细菌、酵母和人类细胞中瞬态形成的分子茶龙组件的原位监测
Summary
Cognate J-domain 蛋白质与 Hsp70 伴护器合作，协助处理从蛋白质折叠到降解的各种生物过程。在这里，我们描述了一个原位接近结扎测定，它允许监测这些瞬时形成的伴菌机在细菌，酵母和人类细胞。
Abstract
J-domain蛋白（JdPs）是真核细胞中最大、最多样化的共体细胞家族。最近的发现表明，JDP家族的特定成员可以在真核生物中形成瞬态异质复合物，以微调70 kDa热休克蛋白（Hsp70）基于配体蛋白的基质选择。JDP复合物针对急性/慢性应激诱导的聚合蛋白，并可能通过在蛋白质聚合体表面招募多个Hsp70s来帮助组装分离的气体。这些物理相互作用的JdPs形成的蛋白质质量控制（PQC）网络在体内基本上没有特征。在这里，我们描述了一种基于显微镜的原位蛋白相互作用测定，名为接近结扎测定（PLA），它能够在真核细胞的不同细胞隔间中强有力地捕获这些瞬时形成的伴结复合物。我们的工作将PLA的用法从人类细胞扩展到酵母（糖母细胞）和细菌（大肠杆菌），从而成为监测两者中瞬态形成的蛋白质组体的动力学的重要工具。原核细胞和真核细胞。
Introduction
由于我们对细胞相互作用的不完全了解，大量的基因组信息仍然无法解释。传统的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，如蛋白质共免疫沉淀与/没有化学交联和蛋白质共定位，虽然广泛使用，造成一系列缺点。一些主要缺点包括相互作用的量化不佳，以及可能引入非本机绑定事件。相比之下，新兴的基于接近的技术为捕获细胞中的蛋白质相互作用提供了另一种强有力的方法。接近结扎测定（PLA）1，现在作为专有试剂盒提供，利用抗体根据相互作用亚单位的接近度专门靶向蛋白质复合物。
PLA是由在靶向蛋白复合物表面形成一个脚手架，由具有小DNA标记（PLA探针）的初级和二级抗体组成（图1，步骤1-3）。接下来，由DNA标记的接近性决定，一个圆形DNA分子通过与连接器寡核苷酸杂交产生（图1，步骤4）。圆形DNA的形成通过DNA结扎步骤完成。新形成的圆形DNA片作为后续滚环扩增（RCA）型聚合酶链反应（PCR）的模板，由其中一个结合的寡核苷酸标记。这通过抗体支架产生单链连体DNA分子附着在蛋白质复合物上（图1，步骤6）。串联DNA分子是使用荧光标记的寡核苷酸进行可视化的，这种核苷酸杂交到分散在扩增DNA上的多个独特序列（图1，步骤7）2。生成的PLA信号，显示为荧光点（图1，步骤7），对应于细胞中靶向蛋白质复合物的位置。因此，该测定可以检测高空间精度的蛋白质复合物。该技术并不仅限于捕获蛋白质相互作用，但也可用于检测高灵敏度1，2的蛋白质上的单个分子或蛋白质修饰。
Hsp70 通过参与一系列内务管理和与压力相关的功能，形成了一个高度通用的护套系统，对于维持细胞蛋白平衡至关重要。Hsp70伴郎系统的家政活动包括脱新蛋白折叠、细胞膜中蛋白质易位、蛋白质复合物的组装和拆解、蛋白质活性的调节以及连接不同的蛋白质折叠/质量控制机器3.同样的伴松系统还重新折叠错折叠/展开的蛋白质，防止蛋白质聚集，促进蛋白质分解，并与细胞蛋白酶合作，降解最终错折叠/损坏的蛋白质，以促进细胞修复后蛋白毒性应力4，5。为了实现这种功能多样性，Hsp70 伴侣依赖于 JDP 家族的合作伙伴和核苷酸交换因子 （NEF），这些因子可微调 Hsp70 的基于 ATP 的基板结合和释放3的依合体控制， 6.此外，JDP共同护带器在选择这种多功能护带系统的基板方面发挥着至关重要的作用。这个家族的成员根据他们与原型JDP（大肠杆菌DnaJ）的结构同源性，被细分为三类（A、B和C）。 A 类 JKP 包含一个 N 端 J 域，该域与 Hsp70、甘氨酸-苯丙氨酸富集区、由锌手指状区域 （ZFLR） 和两个 β管域组成的基板结合区域以及一个 C-终端二分化域。具有 N 端 J 域和甘氨酸-苯丙氨酸富区但缺少 ZFLR 的 JSP 属于 B 类。通常，这两个类的成员都参与伴校函数。属于C类的会员，其中只包含共享J域4的JdP，招募Hsp70执行各种非伴奏功能。Hsp70 系统作为可互换基板识别”适配器”的重要作用体现在在进化过程中家庭成员的扩展。例如，人类有超过42个不同的JDP成员4。这些JJD功能作为单体，同构体和/或同质/异质寡聚物4，5。最近，通过A类之间的瞬态复杂形成进行功能合作（例如，H.智人DNAJA2;S. cerevisae Ydj1） 和 B 类（例如，H.智人DNAJB1;据报道，S.cerevisiae Sis1）真核JGP促进在体外7、8对非晶蛋白聚集物的有效识别。这些混合类JDP复合物大概在聚合蛋白的表面组装，以促进Hsp70-和Hsp70_Hsp100基蛋白的分解7，8，9，10.支持这些在真核细胞中暂时形成的混合类JDP复合物存在的关键证据被PLA8提供。
PLA越来越多地用于评估元动物的蛋白质相互作用，主要是哺乳动物细胞。在这里，我们报告这项技术的成功扩展，以监测真核和原核单细胞生物中暂时形成的伴生复合物，如萌芽酵母S.cerevisae和大肠杆菌。重要的是，这种扩展凸显了PLA在检测和分析感染人类和动物细胞的微生物方面的潜在用途。
Protocol
Representative Results
Discussion
基于共免疫沉淀和共同定位的方法一直被用作描述蛋白质组装的长期方法。检测瞬时形成的特定伴郎复合物是这种传统方法的一大挑战，因此，以前的发现主要限于定性解释。基于细胞莱沙的共免疫沉淀技术通常需要交联以稳定蛋白质-蛋白质的相互作用。细胞莱沙会增加破坏瞬时形成的伴生复合物的风险，而交联可能引入非原生相互作用，特别是由大多数伴生者固有的”粘性”驱动。当使用共免疫?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NBN由莫纳什大学医学护理与健康科学学院提供特别招聘补助金，维多利亚州政府和澳大利亚政府提供资金。我们感谢伯恩德·布考（德国海德堡大学ZMBH）和哈姆·坎金加（荷兰格罗宁根大学细胞与系统生物医学科学系）对试剂霍尔格·洛伦茨（ZMBH）的宝贵支持和共享德国海德堡大学成像设施，支持共聚焦显微镜和图像处理，克莱尔·赫斯特（澳大利亚莫纳什大学ARMI）对手稿进行批判性阅读。
Materials
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
Riferimenti
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
