Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Summary

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Abstract

As proteínas do J-domínio (jdps) formam a família a maior e a mais diversa do co-Chaperone em pilhas eucarióticas. Os resultados recentes mostram que os membros específicos da família de JDP poderiam dar forma a heterocomplexos transientes nos eucariotas para ajustar a seleção da carcaça para a proteína de choque do calor de 70 kDa (HSP70)-base Chaperone-baseada disaggregases. Os complexos de JDP visam o estresse agudo/crônico induzido por proteínas agregadas e, presumivelmente, ajudam a montar os disaggregases recrutando múltiplos Hsp70s para a superfície de agregados proteicos. A extensão da rede de controle de qualidade proteica (PQC) formada por esses JDPs fisicamente interagindo permanece em grande parte não caracterizada in vivo. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ microscopia-baseado da interação da proteína nomeado o ensaio da ligadura da proximidade (PLA), que é capaz de capturar robustamente estes complexos transientemente formados do acompanhante em compartimentos celulares distintos de pilhas eucarióticas. Nosso trabalho amplia o emprego de PLA de células humanas a leveduras (Saccharomyces cerevisiae) e bactérias (Escherichia coli), tornando assim uma importante ferramenta para monitorar a dinâmica de conjuntos proteicos transientemente formados em ambos os células procarióticas e eucarióticas.

Introduction

Uma quantidade vasta de informação genomic permanece indefinidos devido a nossa compreensão incompleta de interactomes celulares. As metodologias convencionais de detecção de interação proteína-proteína, como a co-imunoprecipitação protéica com/sem ligação cruzada química e colocalização protéica, embora amplamente utilizadas, apresentam uma série de desvantagens. Algumas das principais desvantagens incluem a má quantificação das interações e a potencial introdução de eventos vinculativos não nativos. Em comparação, as técnicas emergentes de proximidade fornecem uma alternativa e uma abordagem poderosa para capturar interações protéicas nas células. O ensaio de ligadura de proximidade (PLA)¹, agora disponível como um kit proprietário, emprega anticorpos especificamente destinados a complexos proteicos com base na proximidade das subunidades interagindo.

O PLA é iniciado pela formação de um andaime constituído por anticorpos primários e secundários com pequenas Tags de DNA (sondas PLA) na superfície do complexo proteico alvo (Figura 1, etapas 1-3). Em seguida, determinada pela proximidade das tags de DNA, uma molécula de DNA circular é gerada através da hibridação com oligonucleotídeos do conector (Figura 1, etapa 4). A formação do ADN circular é terminada por uma etapa da ligadura do ADN. A parte circular recentemente formada de ADN sere como um molde para a amplificação subseqüente do círculo do rolamento (RCA)-baseou a reacção em cadeia do polymerase (PCR) aprontado por um dos Tag conjugado do oligonucleotide. Isto gera uma molécula de DNA concatemeric única-encalhado unida ao complexo da proteína através do andaime do anticorpo (Figura 1, etapa 6). A molécula concatemeric do ADN é visualizada usando os oligonucleotídeos cDNAs etiquetados que hibridizam às seqüências originais múltiplas dispersadas através do ADN amplificado (Figura 1, etapa 7)². O sinal do PLA gerado, que aparece como um ponto fluorescente (Figura 1, etapa 7), corresponde à posição do complexo alvejado da proteína na pilha. Como resultado, o ensaio poderia detectar complexos proteicos com alta precisão espacial. A técnica não se limita a simplesmente captar interações proteicas, mas também pode ser utilizada para detectar moléculas únicas ou modificações protéicas em proteínas com alta sensibilidade^1,2.

HSP70 forma um sistema de acompanhante altamente versátil fundamentalmente importante para manter a homeostase de proteínas celulares, participando de uma série de tarefas domésticas e funções associadas ao stress. As atividades de limpeza do sistema de acompanhante HSP70 incluem dobradura de proteína de novo, translocação de proteínas através de membranas celulares, montagem e desmontagem de complexos proteicos, regulação da atividade proteica e vinculação de diferentes proteínas dobráveis/ controle de qualidade machineries³. O mesmo sistema de acompanhante igualmente redobra proteínas desdobradas/unfolded, impede a agregação da proteína, promove a desagregação da proteína e coopera com proteases celulares para degradar as proteínas terminalmente misfolded/danificadas para facilitar o reparo celular após tensões proteotóxicas^4,5. Para alcançar essa diversidade funcional, a Chaperona HSP70 confia em parcerias de cochaperonas da família JDP e fatores de troca de nucleotídeo (NEFs) que afinar o controle alostérico dependente de Hsp70’s ATP de ligação de substrato e liberação^3, a ⁶. Além disso, os cochaperones JDP desempenham um papel vital na seleção de substratos para este sistema de acompanhante versátil. Os membros desta família são subdivididos em três classes (A, B e C) com base em sua homologia estrutural para o protótipo JDP, o E. coli DnaJ. Os jdps da classe A contêm um N-terminal J-Domain, que interage com o HSP70, uma região rica da glicina-fenilalanina, uma região obrigatória da carcaça que consiste em um zinco dedo-como a região (zflr) e dois domínios do β-tambor, e um domínio do dimerização do C-terminal. JDPs com um N-terminal J-domínio e um glicina-fenilalanina rica região, mas faltando o ZFLR, cair na classe B. Em geral, os membros dessas duas classes estão envolvidos em funções de chaperoning. Membros que caem a classe C do catchall, que contem os JDPs que compartilham somente do J-domínio⁴, recruta Hsp70s para executar uma variedade de funções não-chaperoning. O importante papel dos JDPs como “adaptadores” de reconhecimento de substrato intercambiáveis do sistema HSP70 é refletido por uma expansão dos membros da família durante a evolução. Por exemplo, os seres humanos têm sobre 42 Membros distintos⁴de JDP. Estes jdps funcionam como monómeros, homodimers e/ou oligômeros homo/hetero^4,5. Recentemente, uma cooperação funcional através da formação complexa transiente entre A classe A (por exemplo, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) e classe B (p. ex., H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) o jdps eucarióticas foi relatado para promover o reconhecimento eficiente de agregados amorfos da proteína in vitro^7,8. Estes complexos da classe misturada JDP presumivelmente montam na superfície de proteínas agregadas para facilitar a formação de HSP70-e HSP70 + Hsp100-based disaggregases da proteína^{7,8,9, 10}. a evidência crítica para apoiar a existência destes complexos de classe mista de JDP em células eucarióticas foi formada transientemente com o PLA⁸.

O PLA é empregado cada vez mais para avaliar interações da proteína no Metazoa, primeiramente em pilhas mamíferos. Aqui, nós relatamos a expansão bem sucedida desta técnica para monitorar os complexos transientemente formados do acompanhante em organismos unicelulares eucarióticas e procarióticas tais como o fermento de brotamento S. cerevisiae e a bactéria e . coli. Importante, esta expansão destaca o uso potencial do PLA em detectar e em analisar os micróbios que infectam pilhas humanas e animais.

Protocol

1. HeLa preparação celular Prepare os seguintes materiais: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4), pH 7,4; DMEM, suplementado com 10% FCS e 1% Pen-Strep; paraformaldeído a 4% em PBS; 0,5% Triton-X100 em PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0, 5% Tween), pH 7,4; 0, 1% solução estéril de poli-L-lisina; lâminas diagnósticas de 10 poços; uma câmara húmida; papel tissue; e frascos de coloração da corrediça de Coplin.Nota:</str…

Representative Results

Nossos estudos in vitro prévios usando proteínas purificadas revelaram que um subconjunto de classe humana A e de classe B JDPs formam complexos transientes de classe mista JDP para direcionar eficientemente uma ampla gama de proteínas agregadas e possivelmente facilitar a montagem de HSP70-based disaggregases proteicos7. Nós empregamos o PLA para determinar se os complexos da classe misturada (A + B) JDP ocorrem em pilhas de cancro cervicais humanas (HeLa). Os JDPs humanos DNAJA2 (classe A) e…

Discussion

As abordagens baseadas em coimunoprecipitação e colocalização têm sido utilizadas como métodos de longa data para caracterizar as montagens de proteínas. A detecção de complexos de Chaperona em forma transitória é um grande desafio com tais métodos convencionais e, como resultado, os achados anteriores são largamente restritos a interpretações qualitativas. As técnicas de coimunoprecipitação à base de lise celular geralmente exigem cross-linking para estabilizar interações proteína-proteína. A lis…

Materials

37% Formaldehyde	Merck	103999
Acetone	Sigma-Aldrich	32201
anti-DNAJA2 antibody	Abcam	ab157216
anti-DNAJB1 Antibody	Enzo Life Sciences	ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody	In house
anti-mCherry antibody	Abcam	ab125096
anti-Sis1 Antibody	Cosmo Bio Corp	COP-080051
anti-Ydj1 antibody	StressMarq Biosciences	SMC-150,
anti-YFP antibody	In house
Coplin slide-staining jar	Sigma-Aldrich	S5516
Diagnostic slides	Marienfeld	1216530
DMEM	Thermo-Fischer	31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange	Sigma-Aldrich	DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma-Aldrich	DUO82049
Fetal Calf Serum	Thermo-Fischer	10082147
Lysozyme	Sigma-Aldrich	62971
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fischer	15070063
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P47-07
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S7547
Triton-X100	Merck	108643
Trypsin	Thermo-Fischer	25300096
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Zymolase 100T / / Lyticase	United States Biological	Z1004