Abbiamo esposto un sistema microfisiologico (MPS) con organoidi intestinali e epatici ad acetaminofene (APAP). Questo articolo descrive i metodi per la produzione di organoidi e le valutazioni della proprietà farmacocinetica e tossicologica APAP nelle MPS. Descrive anche le analisi della funzionalità tissutale necessarie per convalidare i risultati.
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Articolo metodologico
Un sistema microfisiologico intestino/fegato per la valutazione farmacocinetica e tossicologica
In questo articolo
Sommario
Abstract
I sistemi microfisiologici (MPS) recentemente introdotti che coltivano organoidi umani dovrebbero funzionare meglio degli animali nella fase di test preclinici del processo di sviluppo dei farmaci perché sono geneticamente umani e ricapitolano l'interazione tra i tessuti. In questo studio, la barriera intestinale umana (emulata da una co-coltura di cellule Caco-2 e HT-29) e l'equivalente epatico (emulato da sferoidi fatti di cellule EpaRG differenziate e cellule stellate epatiche umane) sono stati integrati in un dispositivo microfluidico a chip a due organi (2-OC) per valutare alcune proprietà farmacocinetiche (APAP) ad acetaminofene (APAP) e tossicologiche. La MPS aveva tre gruppi: intestino solo 2-OC, fegato solo 2-OC, e intestino / fegato 2-OC con lo stesso supporto che permea entrambi gli organoidi. Per le valutazioni della chiave di piattaforma, abbiamo dosato l'APAP nel supporto a punti di tempo preimpostati dopo averli somministrati sopra la barriera intestinale (emulando la via orale) o nel supporto (emulando la via endovenosa), rispettivamente a 12 μM e 2 μM. I campioni di supporto sono stati analizzati mediante cromatografia liquida ad alta pressione in fase invertita (HPLC). Gli organoidi sono stati analizzati per l'espressione genica, per i valori TEER, per l'espressione e l'attività proteica, e quindi raccolti, fissati e sottoposti a una serie di valutazioni morfologiche. La tecnica MTT ha funzionato bene nel valutare la fattibilità organoide, ma le analisi ad alto contenuto (HCA) sono state in grado di rilevare eventi tossici molto presto in risposta al trattamento APAP. Abbiamo verificato che il flusso del supporto non influisce in modo significativo sull'assorbimento apap, mentre migliora significativamente la funzionalità equivalente al fegato. L'assorbimento intestinale umano APAP e il metabolismo epatico potrebbero essere emulati nelle MPS. L'associazione tra i dati delle MPS e la modellazione in silico ha un grande potenziale per migliorare la prevedibilità dei metodi in vitro e fornire una migliore accuratezza rispetto ai modelli animali negli studi farmacocinetici e tossicologici.
Introduzione
A causa delle differenze genomiche e proteomiche, i modelli animali hanno un valore predittivo limitato per diversi risultati umani. Inoltre, sono dispendiosi in termini di tempo, costosi ed eticamente discutibili1. Mps è una tecnologia relativamente nuova che mira a migliorare la potenza predittiva e ridurre i costi e il tempo trascorso con i test precli clinici. Sono dispositivi microfluidi che coltivano organoidi (unità funzionali mimetiche artificiali di organi) sotto flusso mediatico che promuovono la comunicazione organoide-organoide. Gli organoidi composti da cellule umane aumentano la rilevanzatraslizionale 2,
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Protocollo
1. Produzione di equivalenti tissutali per la coltivazione nel 2-OC
- Produzione equivalente barriera intestino tenue
- Mantenere le cellule Caco-2 e HT-29 usando il mezzo equivalente intestino: DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina e streptomicina, e 1% amminoacidi non essenziali, che è chiamato come "DMEM S" in questo manoscritto.
- Rimuovere il mezzo, lavare due volte con 1x DPBS e aggiungere 8 mL dello 0,25% di tripina/EDTA per dissociare le cellule Caco-2 coltivate in contenitori di coltura cellulare (175 cm2). Incubare per 5 minuti a 37 °C e interrompere la reazione aggiungendo almeno il doppio volume di inibitore della tri....
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Risultati
Per eseguire i test PK APAP nelle MPS a 2-OC, il primo passo è produrre l'intestino umano e gli equivalenti epatici (organoidi). Sono integrati nel dispositivo microfluidico 2-OC (Figura 1A) 24 ore prima dell'inizio del test APAP PK. Il giorno successivo, il supporto viene modificato e il modello viene esposto all'APAP. La figura 1 illustra gli equivalenti intestinali e epatici collocati all'interno del dispositivo 2-OC (Figura 1B) .......
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Discussione
La valutazione accurata e affidabile delle proprietà farmacologiche dei nuovi farmaci investigativi è fondamentale per ridurre il rischio nelle seguenti fasi di sviluppo. L'MPS è una tecnologia relativamente nuova, che mira a migliorare la potenza predittiva e ridurre i costi e il tempo trascorso con i test preclinici. Il nostro gruppo sta avanzando nella valutazione delle proprietà farmacocinetiche e tossicologiche per lo più necessarie per l'ottimizzazione del piombo. Abbiamo lavorato con il dispositivo microfluidico 2.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Grazie alla Dott.ssa Christie Guguen-Guillouzo, al Dott. Philippe Gripon dell'Unità 522 INSERM e al Dott. Christian Trepo dell'Unità 271 INSERM per l'utilizzo del Materiale Biologico (Cellule Hepa RG) e per averci messo a disposizione per svolgere la ricerca accademica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | Senza calcio, senza magnesio |
| 2-OC | TissUse GmbH | Chip a due organi | |
| Micropiastra sferoidale a 384 pozzetti | Corning | 3830 | Nero/Trasparente, fondo rotondo, attacco ultra-basso |
| 4% Paraformaldeide | Utilizzare per fissare la cella | ||
| Paracetamolo | Sigma Aldrich | A7085 | Utilizzo per i saggi MPS |
| Acetonitrile | Tedia | Utilizzato per eseguire HPLC | |
| Alexa Fluor 647 falloidina | Thermo Fisher Esperimento confocale scientifico | ||
| Acetato di ammonio | Sigma Aldrich | Utilizzato per eseguire HPLC | |
| Cellule Caco-2 | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| tampone | |||
| Fiasche | per colture cellulariSarstedt | ||
| Microscopio confocale a fluorescenza | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM ad alto glucosio | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Aggiungere integratori: 10% siero fetale bovino, 100 unità per mL di penicillina, 100 &; g/mL di streptomicina e l'1% di aminoacidi non essenziali |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Aggiunta del 2% al terreno HepaRG |
| Etanolo | Synth | ||
| Siero fetale bovino | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Mezzo di congelamento OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T. &commercio; Il composto è una formulazione di glicoli e resine idrosolubili, che fornisce una comoda matrice di campioni per il sezionamento del criostato a temperature di -10 gradi; C e inferiori. | |
| Ematossilina & Cellule Eosina | |||
| HepaRG | Biopredic International | HPR101 | Cellule indifferenziate |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cellule e tutti gli integratori di coltura |
| Hoechst 33342 | Esperimenti HCA | ||
| Cellule HT-29 Sigma | Aldrich | 85061109 | |
| Insulina umana | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014 | ||
| Idrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanolo | Merck | 278475 | |
| Karnovsky' s fissativo | |||
| L-glutammina | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 colonna di guardia SS | Phenomenex | Utilizzato per eseguire HPLC | |
| Microscopio | Leica | DMi4000 | |
| Microtomo | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 &; m inserti per pori | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Utilizzato per la misurazione TEER |
| MitoTracker Deep Red | HCA esperimenti | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| Sistema MX3000P | Agilent Technologies | ||
| Camera | NeubauerConteggio delle cellule | ||
| Operetta Sistema di imaging ad alto contenuto | Perkin Elmer | Utilizzato per eseguire il test HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 con luciferina-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillina/Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Colture cellulari |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Primer | |
| RT-qPCR | |||
| Membrana in PVDF | BioRad | ||
| PVDF Filtro | 0,22 μ m dimensione dei pori | ||
| Colonna Luna C18 a fase inversa | Phenomenex | Utilizzato per eseguire l'agitatore HPLC | |
| (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Utilizzato per gli sferoidi per migliorare il saggio MTT |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Aggiungi integratori STeC CM |
| SuperScriptIITM Trascrittasi inversa | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific TRizol | ||
| TM reagente | Thermo Fisher Scientific | Trizol è una soluzione monofasica di fenolo e isotiocianato di guanidina. | |
| Soluzione di tripsina/EDTA | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Piastre ad attacco ultrabasso | Corning | CLS3471-24EA | 6 pozzetti |
| Vectashield più terreno | |||
| Micropiastra bianca opaca a 96 pozzetti | PerkinHelmer | ||
| a foro largo | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Aggiungere integratori: 10% siero fetale bovino, 2 mM di L-glutammina, 100 unità per ml di penicillina, 100 &; g/mL di streptomicina e 5 µ g/mL di insulina umana |
Riferimenti
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A.
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Ristampe e permessi
