İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi
Summary
Biz asetaminofen (APAP) bağırsak ve karaciğer organoidleri ile bir mikrofizyolojik sistem (MPS) maruz. Bu makalede, MPS’de organoid üretim yöntemleri ve APAP farmakokinetik ve toksikolojik özellik değerlendirmeleri açıklanmaktadır. Ayrıca sonuçları doğrulamak için gerekli doku işlevselliği analizleri açıklar.
Abstract
Yakın zamanda tanıtılan mikrofizyolojik sistemlerin (MPS) insan organoidlerini yetiştiren, genetik olarak insan oldukları ve dokular arasındaki etkileşimi yeniden özetledikleri için ilaç geliştirme sürecinin klinik öncesi test aşamasında hayvanlardan daha iyi performans göstermesi beklenmektedir. Bu çalışmada, insan bağırsak bariyeri (Caco-2 ve HT-29 hücrelerinin ortak kültürü ile taklit) ve karaciğer eşdeğeri (farklılaştırılmış HepaRG hücreleri ve insan hepatik stellat hücrelerinden oluşan küresel ler tarafından taklit edilmiştir) bazı asetaminofen (APAP) farmakinetik (PK) ve toksik özellikleri değerlendirmek için iki organlı çip (2-OC) mikroakışkan cihaza entegre edilmiştir. MPS üç derlemeleri vardı: Bağırsak sadece 2-OC, Karaciğer sadece 2-OC, ve Bağırsak / Karaciğer 2-OC aynı ortam her iki organoidperile. PK değerlendirmeleri için, apap’ı bağırsak bariyerinin üzerinden (sözlü rotayı taklit) veya medyada (intravenöz rotayı taklit ederek) uyguladıktan sonra, amedia’ya sırasıyla 12 μM ve 2 μM dozladık. Ortam örnekleri ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz edildi. Organoidler gen ekspresyonu, TEER değerleri, protein ekspresyonu ve aktivitesi için analiz edildi ve daha sonra toplandı, düzeltildi ve bir dizi morfolojik değerlendirmeye sunuldu. MTT tekniği organoid canlılığı değerlendirmede iyi performans gösterdi, ancak yüksek içerik analizleri (HCA) APAP tedavisine yanıt olarak çok erken toksik olayları tespit edebildi. Medya akışının APAP emilimini önemli ölçüde etkilemediğini, ancak karaciğereşdeğerinin işlevselliğini önemli ölçüde iyileştirdiğini doğruladık. APAP insan bağırsak emilimi ve hepatik metabolizma MPS taklit edilebilir. MPS verileri ile silico modelleme arasındaki ilişki, in vitro yöntemlerin öngörülebilirliğini artırmak ve farmakokinetik ve toksikolojik çalışmalarda hayvan modellerinden daha iyi doğruluk sağlamak için büyük bir potansiyele sahiptir.
Introduction
Genomik ve proteomik farklılıklar nedeniyle, hayvan modelleri çeşitli insan sonuçları için sınırlı tahmin değerine sahiptir. Ayrıca, onlar zaman alıcı, pahalı ve etik şüpheli1. MPS, tahmin gücünü artırmayı ve klinik öncesi testler ile harcanan maliyetleri ve zamanı azaltmayı amaçlayan nispeten yeni bir teknolojidir. Organoid-organoid iletişimi teşvik eden medya akışı altında organoidler (organların yapay mimetik fonksiyonel birimleri) yetiştiren mikroakışkan cihazlardır. İnsan hücrelerinden yapılan organoidler çeviri alakaartış 2,3,4. MPS’nin hayvan testlerinden daha iyi performans göstermesi beklenmektedir çünkü genetik olarak insandırlar ve dokular arasındaki etkileşimi özetlerler. Tam olarak işlevsel olduğunda, MPS daha anlamlı sonuçlar sağlayacaktır, daha yüksek hızda ve daha düşük maliyetler ve riskler4. Birçok grup çeşitli amaçlar için MPS geliştiriyor, özellikle hastalığın etkinliğini test etmek için hastalık modelleri.
Maruz kalma düzeyi ilaç etkinliği ve toksisite değerlendirmek için en kritik parametrelerden biridir5,6,7,8,9,10,11,12. MPS sistemik maruziyet taklit organoid entegrasyonu sağlar ve geleneksel 2D insan doku kültüründen daha iyi performans bekleniyor. Bu teknoloji önemli ölçüde bileşik bağırsak emilimi ve karaciğer metabolizması tahmin artırabilir4.
Bağırsak ve karaciğer insan eşdeğer modeli entegre bir MPS iyi bir başlangıç noktasıdır, ilaç biyoyararlanım ve sistemik maruz kalma bu iki organın merkezi rolü göz önüne alındığında13,14,15. APAP onun metaboliti karaciğer tarafından ağırlıklı olarak yapılır çünkü bir MPS okumak için cazip bir ilaçtır16,17.
2-OC iki farklı insan eşdeğer doku / organoidler mikrokanallar16ile birbirine kültür için uygun iki odalı mikroakışkan cihazdır. Bir ilacın in vitro insan oral/intravenöz yönetimini taklit etmek ve bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri arasındaki çapraz konuşmanın APAP farmakokinetiği üzerine etkilerini değerlendirmek için, organoidlerin işlevselliği ve canlılığının yanı sıra, üç farklı MPS derlemesi gerçekleştirildi: (1) 2-OC cihazına entegre edilmiş Caco-2 + HT-29 hücre koculture içeren bir kültür eklemesine dayalı bir bağırsak eşdeğerinden oluşan bir “Bağırsak 2-OC MPS”; (2) 2-OC cihazına entegre edilmiş HepaRG + HHSteC (İnsan Hepatik Stellat Hücreleri) içeren karaciğer küresellerinden oluşan bir “Karaciğer 2-OC MPS”; ve (3) bir cihaz bölmesinde bağırsak eşdeğeri oluşan bir “Bağırsak / Karaciğer 2-OC MPS” mikroakışkan kanallar aracılığıyla medya akışı ile diğer karaciğer eşdeğeri ile iletişim.
Tüm tahliller statik altında yapıldı (hiçbir akış) ve dinamik (akış ile) mekanik uyaranların etkisi nedeniyle (sıkıştırma, germe, ve kesme) hücre canlılığı ve işlevleri18,19,20. Bu makalede, insan bağırsağı ve karaciğer eşdeğeri modelleri içeren 2-OC MPS’de APAP oral/intravenöz uygulama öykünme protokolü ve ilgili emilim/metabolizma ve toksikolojik analizler açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Araştırmacı yeni ilaçların farmakolojik özelliklerinin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, aşağıdaki geliştirme adımlarında riski azaltmak için kritik öneme sahiptir. MPS, tahmin gücünü artırmayı ve klinik öncesi testlerle harcanan maliyetleri ve zamanı azaltmayı amaçlayan nispeten yeni bir teknolojidir. Grubumuz çoğunlukla kurşun optimizasyonu için gerekli olan farmakokinetik ve toksikolojik özelliklerin değerlendirilmesinde ilerlemektedir. İki odası olan ve iki organoidi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Unit 522 INSERM’den Dr. Philippe Gripon ve Ünite 271 INSERM’den Dr. Christian Trepo’ya Biyolojik Materyalin (Hepa RG hücreleri) kullanımı ve akademik araştırmayapmak için bize sunulması için teşekkür ederiz.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
Riferimenti
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
- Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
- Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
- Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
- Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
- Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
- Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
- Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
- Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
- Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
- Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
- Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
- Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
- Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- OECD. OECD TG 491 – Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
- Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
- OECD. OECD TG 492 – Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
- OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 – In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
- OECD. OECD TG 439 – In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
- Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
- Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
- Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).
