Un système microphysiologique intestinal/hépatique pour l’évaluation pharmacocinétique et toxicologique des médicaments
Summary
Nous avons exposé un système microphysiologique (MPS) avec des organoïdes intestinaux et hépatiques à l’acétaminophène (APAP). Cet article décrit les méthodes de production d’organoïdes et d’évaluations des biens pharmacocinétiques et toxicologiques de l’APAP dans le SPM. Il décrit également les analyses de fonctionnalité tissulaire nécessaires pour valider les résultats.
Abstract
On s’attend à ce que les systèmes microphysiologiques (MPS) récemment introduits cultivant des organoïdes humains obtiennent de meilleurs résultats que les animaux dans la phase de tests précliniques du processus de développement de médicaments parce qu’ils sont génétiquement humains et récapitulent l’interaction entre les tissus. Dans cette étude, la barrière intestinale humaine (imitée par une co-culture des cellules Caco-2 et HT-29) et l’équivalent hépatique (imité par des sphéroïdes faits de cellules hepaRG différenciées et de cellules stellates hépatiques humaines) ont été intégrées dans un dispositif microfluidique à puce à deux organes (2 OC) pour évaluer certaines propriétés pharmacocinétiques (PK) et toxicologiques de l’acétaminophène (APAP). Le MPS a eu trois assemblées : intestin seulement 2-OC, foie seulement 2-OC, et intestin/foie 2-OC avec le même média perfusant les deux organoïdes. Pour les évaluations pk, nous avons dosé l’APAP dans les médias à des points de temps prédéfinis après l’avoir administré soit au-dessus de la barrière intestinale (émulation de la voie orale) ou dans les médias (émulsionnant la voie intraveineuse), à 12 μM et 2 μM respectivement. Les échantillons de médias ont été analysés par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) en phase inversée. Des organoïdes ont été analysés pour l’expression de gène, pour des valeurs de TEER, pour l’expression et l’activité de protéine, et puis rassemblés, fixés, et soumis à un ensemble d’évaluations morphologiques. La technique MTT a bien fonctionné dans l’évaluation de la viabilité organoïde, mais les analyses à haute teneur (HCA) ont pu détecter des événements toxiques très tôt en réponse au traitement d’APAP. Nous avons vérifié que le flux de médias n’affecte pas significativement l’absorption apap alors qu’il améliore considérablement la fonctionnalité équivalent foie. L’absorption intestinale humaine d’APAP et le métabolisme hépatique pourraient être imités dans le MPS. L’association entre les données MPS et dans la modélisation silico a un grand potentiel pour améliorer la prévisibilité des méthodes in vitro et fournir une meilleure précision que les modèles animaux dans les études pharmacocinétiques et toxicologiques.
Introduction
En raison des différences génomiques et protéomiques, les modèles animaux ont une valeur prédictive limitée pour plusieurs résultats humains. En outre, ils sont longs, coûteux et éthiquement discutables1. MPS est une technologie relativement nouvelle qui vise à améliorer la puissance prédictive et à réduire les coûts et le temps consacrés aux tests précliniques. Ce sont des dispositifs microfluidiques cultivant des organoïdes (unités fonctionnelles mimétiques artificielles d’organes) sous flux médiatique qui favorise la communication organoïde-organoïde. Les organoïdes faits de cellules humaines augmentent la pertinencetranslationnelle 2,3,4. On s’attend à ce que mps exécute mieux que les essais animaux parce qu’ils sont génétiquement humains et récapitulent l’interaction entre les tissus. Lorsqu’il sera pleinement fonctionnel, le SPM fournira des résultats plus significatifs, à une vitesse plus élevée et à des coûts et à des risquesmoins élevés 4. De nombreux groupes développent le SPM à plusieurs fins, en particulier des modèles de maladies pour évaluer l’efficacité du médicament.
Le niveau d’exposition est l’un des paramètres les plus critiques pour évaluer l’efficacité et latoxicité des médicaments 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS permet l’intégration organoïde qui imite l’exposition systémique et devrait être plus performante que la culture traditionnelle des tissus humains 2D. Cette technologie peut améliorer considérablement la prédiction de l’absorption intestinale composée et du métabolisme defoie 4.
Un MPS intégrant le modèle équivalent humain de l’intestin et du foie est un bon point de départ, considérant le rôle central de ces deux organes dans la biodisponibilité de drogue et l’expositionsystémique 13,14,15. APAP est un médicament attrayant pour l’étude d’un MPS sans équivalent rénal parce que sa métabolisation se fait principalement par lefoie 16,17.
Le 2-OC est un dispositif microfluidique à deux chambres adapté à la culture de deux tissus/organoïdes équivalents humains différents interconnectés par des microcanaux16. Afin d’imiter une administration orale/intraveineuse humaine in vitro d’un médicament et d’évaluer les effets de la conversation croisée entre l’intestin et les équivalents hépatiques sur la pharmacocinétique APAP, outre la fonctionnalité et la viabilité des organoïdes, trois assemblages MPS différents ont été réalisés : (1) un « Intestin 2-OC MPS » composé d’un équivalent intestinal basé dans un insert culturel contenant une coculture de cellules Caco-2 + HT-29, intégré dans le dispositif 2-OC ; (2) un « Liver 2-OC MPS » composé de sphéroïdes hépatiques faits d’HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) intégré dans le dispositif 2-OC; et (3) un « Intestin/Foie 2-OC MPS » composé de l’équivalent intestinal dans un compartiment de dispositif communiquant avec l’équivalent hépatique dans l’autre par le flux médiatique par les canaux microfluidiques.
Tous les analyses ont été effectuées dans des conditions statiques (sans flux) et dynamiques (avec flux) en raison de l’impact des stimuli mécaniques (compression, étirement et cisaillement) sur la viabilité et les fonctionnalitéscellulaires 18,19,20. Le présent article décrit le protocole pour l’émulation orale/intraveineuse d’administration d’APAP et l’absorption/métabolisme respectif et les analyses toxicologiques dans le MPS 2-OC contenant l’intestin humain et les modèles équivalents de foie.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’évaluation précise et fiable des propriétés pharmacologiques des nouveaux médicaments d’investigation est essentielle pour réduire le risque dans les étapes de développement suivantes. Le MPS est une technologie relativement nouvelle, qui vise à améliorer la puissance prédictive et à réduire les coûts et le temps consacrés aux tests précliniques. Notre groupe progresse dans l’évaluation des propriétés pharmacocinétiques et toxicologiques principalement nécessaires à l’optimisation du plomb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Christie Guguen-Guillouzo, le Dr Philippe Gripon de l’Unité 522 INSERM et le Dr Christian Trepo de l’Unité 271 INSERM pour l’utilisation du matériel biologique (cellules Hepa RG) et pour nous avoir mis à notre disposition afin d’effectuer la recherche universitaire.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
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