توليد التدرجات المخدرات غير متجانسة عبر السكان السرطان على مسرّع تطور Microfluidic للمراقبة في الوقت الحقيقي
Summary
نقدم نموذج السرطان على رقاقة microfluidic، تكنولوجيا “مسرّع التطور”، والتي توفر منصة يمكن التحكم فيها للدراسات الكمية في الوقت الحقيقي على المدى الطويل لديناميات السرطان ضمن ظروف بيئية محددة جيدا في الخلية الواحدة مستوي. ومن المتوقع أن تعمل هذه التكنولوجيا كنموذج في المختبر للبحوث الأساسية أو تطوير الأدوية قبل السريرية.
Abstract
لا تزال ثقافة الخلايا التقليدية النموذج ما قبل السريري الأكثر استخداما، على الرغم من قدرتها المحدودة ثبت للتنبؤ بالنتائج السريرية في السرطان. وقد اقترحت نماذج سرطان ميكروفلويديك على رقاقة لسد الفجوة بين الثقافات التقليدية المفرطة في الأبعاد التقليدية ونماذج الحيوانات أكثر تعقيدا، والتي لديها قدرة محدودة على تحقيق نتائج كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ. هنا، نقدم نموذج سرطان ميكروفلويديك على رقاقة التي تستنسخ المكونات الرئيسية للبيئة الدقيقة الورم معقدة بطريقة شاملة، ولكن بسيطة بما فيه الكفاية لتوفير أوصاف كمية قوية لديناميات السرطان. هذا النموذج microfluidic السرطان على رقاقة، “مسرع التطور”، ينهار مجموعة كبيرة من الخلايا السرطانية في مجموعة مترابطة من البيئات الدقيقة الورم في حين توليد المناظر الطبيعية الإجهاد العلاج الكيميائي غير متجانسة. ويمكن رصد تطور السرطان ودينامياته التطورية استجابة لتدرج المخدرات لأسابيع في الوقت الحقيقي، ويمكن إجراء العديد من التجارب النهائية المكملة للصور الفاصلة زمنيا التي التقطت خلال التجارب.
Introduction
وقد أصبح من المسلم به على نحو متزايد أن السرطان نظام إيكولوجي معقد لا يعتمد فقط على استمرار خلل تنظيم مجموعات الخلايا المتحولة، بل أيضا على التفاعلات الحيوية بين الخلايا السرطانية والبيئة الصغرى المضيفة. وبهذا المعنى، يتطور السرطان على مشهد متكيف يتجلى في مجموعة من العوامل، بما في ذلك البيئة الدقيقة للورم غير المتجانس والتقاطع مع مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة، وكلها تساهم في ضغوط انتقائية لمزيد من الجينات أو التغيرات الجينيّة1،2،3. في سياق الأورام الصلبة، والتوزيع غير المتكافئ للعلاج الكيميائي وغيرها من التدرجات الموارد يساهم في عدم تجانسها الجزيئي، ويمكن أن تلعب دورا في تطوير مقاومة المخدرات، وزيادة تكوين الأوعية الدموية إلى ورم معين التجمعات السكانية الفرعية، وحتى الانبثاث4،5،6. التقليدية في المختبر 2D دراسات زراعة الخلايا، في حين تمتلك واسعة النطاق، والقدرة التجريبية مريحة، ويوفر متوسط الميدان، موحدة، وظروف ثابتة، وغالبا ما تفتقر إلى الرقابة البيئية المكانية والزمنية الدقيقة اللازمة حقا محاكاة في ديناميات الورم في الجسم الحي. وبالتالي، هناك حاجة إلى نماذج أكثر تمثيلا من الجسم الحي من أجل إعادة إنتاج البيئة الدقيقة الورم قبل النماذج الحيوانية في خط أنابيب تطوير المخدرات من أجل التنبؤ بشكل أفضل من تطور السرطان، فضلا عن الاستجابات للأدوية ضمن الإجهاد الديناميكي المناظر الطبيعيه. وقد تم اقتراح Microfluidics لسد الفجوة بين دراسات زراعة الخلايا 2D وأكثر تعقيدا في الدراسات الحيوانية الحية التي قد لا تكون قادرة على دعم الدراسات الكمية التي يمكن السيطرة عليها7،8،9.
يجب أن يمتلك النظام المثالي في المختبر لتوصيف ديناميات الخلايا السرطانية القدرة على توليد بيئة دقيقة غير متجانسة لمحاكاة الاستجابات الخلوية التكيفية التي قد تحدث في الورم، وكذلك السماح بمراقبة هذه الديناميات في دقة خلية واحدة. في هذه المقالة، ونحن نصف منصة ثقافة الخلية microfluidic، جهاز يستند إلى PDMS يسمى “مسرع التطور” (EA)، الذي يسمح للدراسات الموازية في المختبر من ديناميات الخلايا السرطانية في القرار الخلوي مع الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي على مدى على مدى أسابيع، مع الحفاظ على التدرجات من الإجهاد في جميع أنحاء المشهد الثقافي. ويستند تصميم هذه المنصة على عملنا السابق، الذي يمكن تسريع الديناميات التطورية للكائنات الحية في ميتاالسكان10،11. وعلى وجه التحديد، في مجموعة من المجموعات السكانية المنفصلة مكانيا التي تتفاعل على مستوى ما، عندما تتعرض لمشهد إجهاد غير متجانس، يمكن للأنواع الأكثر ملاءمة أن تهيمن على السكان المحليين بشكل أسرع مقارنة بسكان موحدين. ثم تهاجر الأنواع المفيدة إلى الموائل الصغرى المجاورة بحثاً عن الموارد والفضاء، وتهيمن في نهاية المطاف على جميع السكان. كما هو مبين في الشكل 1،يتكون نمط رقاقة EA microfluidic من (1) زوج من القنوات السربنتين التي توفر تداول وسائل الإعلام الجديدة وبناء ظروف حدود ثابتة لنشر المواد الكيميائية، و ‘2’ منطقة زراعة الخلايا سداسية الذي يتكون من 109 غرف سداسية مترابطة و 24 غرف نصف سداسية في المركز، تشبه بنية قرص العسل. الرقاقة هي 100 ميكرومتر في العمق. ترتبط القنوات الإعلامية ومنطقة زراعة الخلايا بالشقوق الصغيرة (حوالي 15 ميكرومتر)، والتي تمنع التدفق المباشر لوسائل الإعلام وما ينتج عنذلك من إجهاد القص عبر منطقة زراعة الخلايا، ومع ذلك لا تزال تسمح للمواد الكيميائية بالانتشار من خلال الشقوق الصغيرة وتبادل المواد الغذائية، النفايات الأيضية، الخ. ويبين الشكل 1باءتوليد التدرجات الكيميائية، حيث تحتوي إحدى القنوات الإعلامية على 0.1 مليون متر من الفلورسين بينما تكون القناة الأخرى خالية من الفلورسين. يتم زراعة الخلايا على غشاء نفاذية الغاز، مغلفة من قبل الهياكل الدقيقة من خلال الضغط الخلفي الإيجابي على الغشاء ضد رقاقة. يتم توضيح مكونات حامل الجهاز في الشكل 2،ويتم توضيح الإعداد التجريبي في الشكل 3،حيث يتم الحفاظ على الثقافة على المجهر المقلوب عند 37 درجة مئوية، مع الرطوبة النسبية فوق 85٪، ومكيفة تحت تكوين غاز نورموكسيا.
يوفر هذا النظام مراقبة تفصيلية للتفاعلات الخلوية المترجمة عبر قنوات برايتفيلد والفلورسنت ويسمح باختبارات المصب التي تم حلها مكانياً مثل الفلورة المناعية أو البقعة الغربية أو قياس الطيف الكتلي. لقد أثبتنا سابقا كدليل على المبدأ من هذا النموذج سرطان microfluidic على رقاقة على الثقافة المشتركة على المدى الطويل من الظهارية وmesenchymal PC3 خلايا سرطان البروستاتا12، فضلا عن ظهور المخدرات المقاومة للعملاق متعدد البلويد الخلايا السرطانية باستخدام خط الخلية PC3 الظهارية13. في حين أننا نقدم تطبيق هذه المنصة لفهم ديناميات spatiotime من PC3 الظهارية وخلايا سرطان البروستاتا mesenchymal تحت تدرج الإجهاد من docetaxel، يمكن تطبيق نظام microfluidic بسهولة على أي مزيج من خطوط الخلايا والموارد (أي المخدرات والمغذيات والأكسجين) التدرجات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وضعت ثقافة الخلايا التقليدية منذ ما يقرب من قرن من الزمان، ولا تزال النموذج ما قبل السريرية الأكثر استخداما في البحوث الطبية الحيوية، على الرغم من قدرتها المحدودة ثبت للتنبؤ النتائج السريرية في السرطان17. النماذج الحيوانية توفر أعلى الأهمية الفسيولوجية والتشابه الوراثي …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
