在微流体进化加速器上生成跨癌症人群的异构药物梯度，用于实时观察
Summary
我们提出了一个微流体癌片模型，即”进化加速器”技术，它为在单细胞明确定义的环境条件下癌症动力学的长期实时定量研究提供了一个可控的平台水平。这项技术有望成为基础研究或临床前药物开发的体外模型。
Abstract
传统的细胞培养仍然是最常用的临床前模型，尽管它被证明是有限的能力，预测癌症的临床结果。提出了微流体癌片模型，以弥合过于简化的传统二维培养法与更复杂的动物模型之间的差距，后者产生可靠和可重复的定量结果的能力有限。在这里，我们提出了一个微流体癌片模型，该模型以全面的方式再现复杂肿瘤微环境的关键成分，但简单到足以提供可靠的癌症动力学定量描述。这种微流体癌片模型”进化加速器”将大量癌细胞分解成一系列相互关联的肿瘤微环境，同时生成异构化疗应激环境。癌症在药物梯度反应下的进展和进化动态可以实时监测数周，并且可以进行许多下游实验，以补充实验过程中拍摄的延时图像。
Introduction
癌症已日益被公认为是一个复杂的生态系统，它不仅取决于突变细胞群的持续调节，还取决于癌细胞与宿主微环境之间的重要相互作用。从这个意义上说，癌症在一个适应性的景观上进化，表现为多种因素，包括异质肿瘤微环境和与各种宿主细胞的串扰，所有这些都为进一步的遗传或表观遗传变化1，2，3。在实体肿瘤的情况下，化疗和其他资源梯度分布不均匀，有助于其分子异质性，并可能在耐药性的发展中发挥作用，增加特定肿瘤的血管生成亚种群，甚至转移4，5，6。传统的体外二维细胞培养研究，虽然拥有大规模、方便的实验能力，但提供均场、均匀和固定条件，往往缺乏真正所需的精确的空间和时间环境控制模拟体内肿瘤动力学。因此，需要更具代表性的外体模型在药物开发管道中的动物模型之前重现肿瘤微环境，以便更好地预测癌症进展以及动态压力内对药物的反应景观。微流体学已被提出来弥合二维细胞培养研究与更复杂的体内动物研究之间的差距，这些研究可能无法支持可控的定量研究7、8、9。
一个理想的体外系统来描述癌细胞动力学应该具有产生异构微环境的能力，以模拟在肿瘤中可能发生的适应性细胞反应，并允许在单细胞分辨率。在本文中，我们描述了一个微流体细胞培养平台，一种基于PDMS的设备，称为”进化加速器”（EA），它允许在细胞分辨率下对癌细胞动力学进行平行体外研究，并实时采集周，同时稳定地保持整个文化景观的压力梯度。这个平台的设计是基于我们以前的工作，其中生物体的进化动力学在元种群可以加速10，11。具体来说，在一组空间分离的种群中，当暴露于异质应力景观时，与大型统一种群相比，最适合的物种可以更快地在本地种群中占据主导地位。有利的物种然后迁移到邻近的微生境，以寻找资源和空间，并最终主宰整个种群。如图1所示，微流体EA芯片的图案由（i）一对蛇形通道组成，这些通道提供新鲜的介质循环，为化学扩散构造固定边界条件;（ii）六边细胞培养区它由109个相互连接的六角形和24个半六角形室组成，中间类似蜂窝结构。芯片深度为100μm。介质通道和细胞培养区域与小切线（约15μm宽）相连，防止直接介质流动和产生的剪切应力穿过细胞培养区，但仍允许化学物质通过小切线扩散并交换营养成分，代谢废物等。化学梯度的产生如图1B所示，其中一个介质通道含有0.1 mM的荧光，而另一个通道不含荧光。细胞在气体渗透膜上培养，通过膜上对芯片的正背压由微观结构封装。图2说明了器件支架的部件，实验设置如图3所示，在37°C的倒置显微镜上保持培养，相对湿度超过85%，并在诺莫夏气体成分。
该系统通过明场和荧光通道提供局部细胞相互作用的详细观察，并允许在空间上解决下游测定，如免疫荧光、西显孔或质谱。我们之前已经证明，这种微流体癌片上模型在上皮和中位PC3前列腺癌细胞12的长期共培养，以及耐药性多倍体巨的出现，作为原理的证明癌细胞使用上皮PC3细胞系13。尽管我们介绍了该平台的应用，以了解上皮PC3和间质性前列腺癌细胞在多西他塞的应力梯度下的时空动力学，但微流体系统可以很容易地应用于细胞系的任意组合和资源（即药物、营养、氧气）梯度。
Protocol
Representative Results
Discussion
传统细胞培养技术是近一个世纪前发展起来的，尽管事实证明，它预测癌症临床结果的能力有限，但它仍然是生物医学研究中最常用的临床前模型。动物模型具有最高的生理相关性和合理的基因相似性，但长期以来，人们一直承认在预测人类结果方面存在重大局限性。在现有的所有临床前模型中，微流体癌片模型似乎是最有前途的候选者，以满足癌症研究未满?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NSF PHY-1659940的支持。
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
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