Summary

Generering af heterogene stof gradienter på tværs af Cancer populationer på en Microfluidic Evolution Accelerator for real-time observation

Published: September 19, 2019
doi:

Summary

Vi præsenterer en mikrofluidisk Cancer-on-chip model, “Evolution Accelerator” teknologi, som giver en kontrollerbar platform for langsigtede real-time kvantitative undersøgelser af Cancer dynamik inden for veldefinerede miljømæssige forhold på enkelt-celle Niveau. Denne teknologi forventes at fungere som en in vitro-model for grundforskning eller præklinisk lægemiddeludvikling.

Abstract

Konventionel cellekultur er fortsat den hyppigst anvendte prækliniske model, på trods af dens påviste begrænsede evne til at forudsige kliniske resultater i cancer. Microfluidic Cancer-on-chip-modeller er blevet foreslået for at bygge bro mellem de overforenklede konventionelle 2D-kulturer og mere komplicerede dyremodeller, som har begrænset evne til at producere pålidelige og reproducerbare kvantitative resultater. Her præsenterer vi en mikrofluidisk Cancer-on-chip model, der gengiver centrale komponenter i en kompleks tumor mikromiljø på en omfattende måde, men er enkel nok til at give robuste kvantitative beskrivelser af kræft dynamik. Denne mikrofluidisk Cancer-on-chip model, “Evolution Accelerator,” nedbryder en stor population af kræftceller i en sammenkoblet vifte af tumor mikromiljøer samtidig generere en heterogene kemoterapeutiske stress landskab. Progression og evolutionære dynamik kræft som reaktion på narkotika gradient kan overvåges i ugevis i realtid, og talrige downstream eksperimenter kan udføres supplerer de tidsforskudt billeder taget gennemløbet af eksperimenter.

Introduction

Kræft er i stigende grad blevet anerkendt som et komplekst økosystem, der ikke kun afhænger af den fortsatte dysregulering af muterede cellepopulationer, men også af vitale interaktioner mellem kræftceller og værts mikromiljøet. I denne forstand udvikler kræften sig på et adaptivt landskab, der manifesteres ved en kombination af faktorer, herunder et heterogent tumor mikromiljø og kryds stilk med en række værtsceller, som alle bidrager med selektivt pres for yderligere genetiske eller Epigenetiske ændringer1,2,3. I forbindelse med solide tumorer, ulige fordeling af kemoterapeutika og andre ressource gradienter bidrager til deres molekylære heterogenitet og kan spille en rolle i udviklingen af resistens over for lægemidler, øget angiogenese til særlige tumor subpopulationer, og endda metastase4,5,6. Konventionelle in vitro 2D cellekultur undersøgelser, mens besidder storstilet, praktisk eksperimentel kapacitet, giver middel-felt, ensartede, og faste betingelser, ofte mangler den præcise rumlige og tidsmæssige miljøkontrol nødvendig for virkelig emulere in vivo tumor dynamik. Der er således behov for mere repræsentative ex vivo-modeller til reproduktion af tumor mikromiljøet forud for dyremodeller i narkotika udviklings rørledningen for at opnå en bedre forudsigelse af kræft progression samt reaktioner på lægemidler inden for dynamisk stress Landskaber. Mikrofluidics er blevet foreslået for at bygge bro over kløften mellem 2D cellekultur studier og mere komplekse in vivo dyreforsøg, der muligvis ikke kan understøtte kontrollerbar kvantitativ undersøgelse7,8,9.

En ideel in vitro-system til at karakterisere kræft celle dynamik bør besidde evnen til at generere en heterogen mikromiljø til at efterligne adaptive cellulære reaktioner, der kan finde sted i en tumor, samt give mulighed for observation af disse dynamikker på en enkelt celle opløsning. I denne artikel beskriver vi en mikrofluidic cellekultur platform, en PDMS-baseret enhed kaldet “Evolution Accelerator” (EA), der giver mulighed for parallelle in vitro-undersøgelser af cancer celle dynamik ved cellulær opløsning med realtidsdata indsamling over løbet af uger, mens stabilt fastholde gradienter af stress på tværs af kulturlandskab. Udformningen af denne platform er baseret på vores tidligere arbejde, hvor den evolutionære dynamik af organismer i en Tjurer kan accelereres10,11. Specifikt i en gruppe af rumligt adskilte populationer, der interagerer på et eller andet niveau, når de udsættes for et heterogene stress landskab, de mest fit arter kan dominere i en lokalbefolkning hurtigere sammenlignet med en stor ensartet population. De fordelagtige arter derefter migrere til tilstødende mikrohabitater i søgen efter ressourcer og plads, og i sidste ende dominere hele befolkningen. Som vist i figur 1består mønsteret af den mikrofluidiske EA-chip af (i) et par Serpentine kanaler, der giver frisk medie cirkulation og konstruerer fast Grænsebetingelser for kemisk diffusion, og II) det sekskantede celle dyrkningsområde som består 109 indbyrdes forbundne sekskantede og 24 halvt-sekskantede kamre i midten, der ligner en honeycomb struktur. Chippen er 100 μm i dybden. Mediekanaler og cellekultur region er forbundet med små slidser (ca. 15 μm bred), som forhindrer direkte medieflow og den resulterende forskydningsbelastning på tværs af cellekultur området, men stadig tillader kemikalier at diffus gennem små slidser og udveksle næringsstoffer, metabolisk affald osv. Genereringen af kemiske gradienter er påvist i figur 1B, hvor en mediekanal indeholder 0,1 mm fluorescein, mens den anden kanal er fri for fluorescein. Celler dyrkes på en gasgennemtrængelig membran, indkapslet af mikrostrukturerne gennem det positive tilbage tryk på membranen mod chippen. Komponenterne i anordningen er illustreret i figur 2, og den eksperimentelle opsætning er illustreret i figur 3, hvor kulturen holdes på et inverteret mikroskop ved 37 °c, med over 85% relativ luftfugtighed, og konditioneret under normoxia gas sammensætning.

Dette system giver detaljeret observation af lokaliserede cellulære interaktioner via lysfelt og fluorescerende kanaler og giver mulighed for rumligt løste downstream-assays såsom immunofluorescence, Western blot, eller massespektrometri. Vi har tidligere demonstreret som en proof-of-princip af denne mikrofluidisk Cancer-on-chip model på lang sigt Co-kultur af epitelial og mesenchymal PC3 prostatacancer celler12 samt fremkomsten af Drug-resistens polyploide gigant kræftceller ved hjælp af epitelial PC3 cellelinje13. Mens vi præsenterer anvendelsen af denne platform til at forstå den rumlige dynamik af epitelial PC3 og mesenchymal prostatacancer celler under en stress gradient af Docetaxel, kan det mikrofluidisk system let anvendes til enhver kombination af cellelinjer og ressource (dvs. stoffer, næringsstoffer, ilt) gradienter.

Protocol

1. fabrikation af mikrofluidisk-enhed Generer det ønskede mikrofluidisk mønster ved hjælp af et layout design software (Se supplerende materialer). Fabrikere photomask. Se tabel over materialer for flere detaljer. Ved hjælp af en laser forfatter, skrive mønsteret på en sodavand glasplade belagt med 100 nm af CR og 500 nm af fotoresist AZ1518. Udvikle fotoresist med Developer AZ300MIF for 60 s. Etch væk chrom uden beskyttelse fra fo…

Representative Results

Validering af optimal cellevækst på chipEt vigtigt mål for eksperimentet platform er at gengive centrale komponenter og interaktioner i en kompleks tumor mikromiljø på en omfattende måde, men simpelt nok til at give kvantitative, pålidelige og reproducerbare data. Dette mål kan kun nås, hvis vi har fuld kontrol over de fysiske og biokemiske miljøfaktorer. Vi skal enten udelukke de uønskede faktorer eller finde ud af en måde at indarbejde de ukontrollerbare…

Discussion

Konventionel cellekultur blev udviklet for næsten et århundrede siden og er fortsat den hyppigst anvendte prækliniske model i biomedicinsk forskning, på trods af dens dokumenterede begrænsede evne til at forudsige kliniske resultater i Cancer17. Dyremodeller tilbyder den højeste fysiologiske relevans og rimelige genetiske lighed for mennesker, men har længe været anerkendt for at have betydelige begrænsninger i forudsigelse af menneskelige resultater18. Blandt alle…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af NSF PHY-1659940.

Materials

10 mL BD Luer-Lok tip syringes BD 14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic Sigma-Aldrich A5955 1x anti-anti
AZ 300 MIF Merck KGaA 18441123163 Photoresist developer
AZ1518 Merck KGaA AZ1518 Photoresist
AZ4330 Merck KGaA AZ4330 Photoresist
Cr Chromium Etchant Sigma-Aldrich 651826
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies Corporation 10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter Heidelberg Instruments DWL66+ Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich 379212 For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins New England Small Tube NE-1300-01  .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame ibidi 10929 On-stage incubator 
Luer-Lok 23 G dispensing needle McMaster-Carr 75165A684 To connect syringes and tubings
Lumox dish 35 Sarstedt 94.6077.331 Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165 Dow Electronic Materials Microposit Remover 1165 Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer Bio-Rad Laboratories MSB1001 Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing) McMaster-Carr 9452K114 Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing) McMaster-Carr 9452K74 Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System Plasmatic Systems, Inc Plasma-Preen Oxygen plasma system
RPMI 1640 Life Technologies Corporation 11875-093
Samco RIE800iPB DRIE Samco RIE800iPB Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner SUSS MicroTec MA6 Mask aligner 
Sylgard 184 Silicone Elastomer Fisher Scientific NC9285739 PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher PVA TePla M4L Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) Sigma-Aldrich 448931 For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) Cole-Parmer EW-06419-01 Tubings for media delivery

Riferimenti

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  3. Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
  4. Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
  5. Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
  6. Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
  7. Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
  8. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  9. Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
  10. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  11. Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
  12. Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
  13. Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
  14. Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  17. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  18. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  19. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  20. Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
  21. Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  22. Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
check_url/it/60185?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Lin, K., Torga, G., Sun, Y., Pienta, K. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation. J. Vis. Exp. (151), e60185, doi:10.3791/60185 (2019).

View Video