Generierung heterogener Arzneimittelgradienten über Krebspopulationen auf einem mikrofluidischen Evolutionsbeschleuniger zur Echtzeitbeobachtung
Summary
Wir präsentieren ein mikrofluidisches Krebs-on-Chip-Modell, die “Evolution Accelerator”-Technologie, die eine kontrollierbare Plattform für langfristige Echtzeit-quantitative Studien zur Krebsdynamik innerhalb klar definierter Umweltbedingungen an der Einzelzelle bietet. niveau. Es wird erwartet, dass diese Technologie als In-vitro-Modell für die Grundlagenforschung oder die präklinische Arzneimittelentwicklung funktioniert.
Abstract
Die konventionelle Zellkultur bleibt das am häufigsten verwendete präklinische Modell, trotz seiner nachgewiesenen begrenzten Fähigkeit, klinische Ergebnisse bei Krebs vorherzusagen. Mikrofluidische Krebs-on-Chip-Modelle wurden vorgeschlagen, um die Lücke zwischen den zu vereinfachten konventionellen 2D-Kulturen und komplizierteren Tiermodellen zu überbrücken, die nur begrenzt in der Lage sind, zuverlässige und reproduzierbare quantitative Ergebnisse zu erzielen. Hier stellen wir ein mikrofluidisches Krebs-on-Chip-Modell vor, das Schlüsselkomponenten einer komplexen Tumormikroumgebung umfassend reproduziert, aber einfach genug ist, um robuste quantitative Beschreibungen der Krebsdynamik zu liefern. Dieses mikrofluidische Krebs-on-Chip-Modell, der “Evolution Accelerator”, zerlegt eine große Population von Krebszellen in eine miteinander verbundene Reihe von Tumor-Mikroumgebungen und erzeugt gleichzeitig eine heterogene chemotherapeutische Stresslandschaft. Das Fortschreiten und die evolutionäre Dynamik von Krebs als Reaktion auf den Arzneimittelgradienten können wochenlang in Echtzeit überwacht werden, und zahlreiche nachgelagerte Experimente können komplementär zu den Zeitrafferbildern durchgeführt werden, die im Laufe der Experimente aufgenommen wurden.
Introduction
Krebs wird zunehmend als komplexes Ökosystem anerkannt, das nicht nur von der anhaltenden Dysregulation mutierter Zellpopulationen abhängt, sondern auch von lebenswichtigen Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Mikroumgebung des Wirts. In diesem Sinne entwickelt sich Krebs auf einer adaptiven Landschaft, die sich durch eine Kombination von Faktoren manifestiert, einschließlich einer heterogenen Tumormikroumgebung und Übersprechen mit einer Vielzahl von Wirtszellen, die alle selektive Drücke für weitere genetische oder epigenetische Veränderungen1,2,3. Im Zusammenhang mit soliden Tumoren trägt die ungleichmäßige Verteilung von Chemotherapeutika und anderen Ressourcengradienten zu ihrer molekularen Heterogenität bei und kann eine Rolle bei der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen, erhöhter Angiogenese auf bestimmte Tumortumoren spielen. Subpopulationen und sogar Metastasen4,5,6. Herkömmliche In-vitro-Zellkulturstudien in einer großen, bequemen Experimentellen Kapazität verfügen d.B. bieten mittlere Feld-, Gleichmäßig- und Fixbedingungen, wobei oft die genaue räumliche und zeitliche Umweltkontrolle fehlt, die notwendig ist, um wirklich in vivo Tumordynamik zu emulieren. Daher sind repräsentativere Ex-vivo-Modelle erforderlich, um die Tumormikroumgebung vor Tiermodellen in der Arzneimittelentwicklungspipeline zu reproduzieren, um eine bessere Vorhersage der Krebsprogression sowie Reaktionen auf Medikamente innerhalb dynamischer Belastungen zu erhalten. Landschaften. Mikrofluidik wurde vorgeschlagen, um die Lücke zwischen 2D-Zellkulturstudien und komplexeren in vivo Tierstudien zu überbrücken, die möglicherweise nicht in der Lage sind, kontrollierbare quantitative Studien7,8,9zu unterstützen.
Ein ideales In-vitro-System zur Charakterisierung der Krebszelldynamik sollte die Fähigkeit besitzen, eine heterogene Mikroumgebung zu erzeugen, um die adaptiven zellulären Reaktionen nachzuahmen, die in einem Tumor stattfinden können, und die Beobachtung dieser Dynamik an einem Einzelzellenauflösung. In diesem Artikel beschreiben wir eine plattform für die mikrofluidische Zellkultur, ein PDMS-basiertes Gerät namens “Evolution Accelerator” (EA), das parallele In-vitro-Studien der Krebszelldynamik bei zellulärer Auflösung mit Echtzeit-Datenerfassung über die Wochen, unter stabiler Aufrechterhaltung von Stressgradienten in der gesamten Kulturlandschaft. Das Design dieser Plattform basiert auf unserer bisherigen Arbeit, in der die evolutionäre Dynamik von Organismen in einer Metapopulation beschleunigt werden kann10,11. Insbesondere in einer Gruppe von räumlich getrennten Populationen, die auf einer gewissen Ebene interagieren, können die am besten geeigneten Arten in einer lokalen Population schneller dominieren als eine große einheitliche Population. Die vorteilhafte Art wandert dann auf der Suche nach Ressourcen und Raum in benachbarte Mikrohabitate und dominiert schließlich die gesamte Population. Wie in Abbildung 1dargestellt, besteht das Muster des mikrofluidischen EA-Chips aus (i) einem Paar Serpentinkanäle, die eine Frischmedienzirkulation ermöglichen und feste Randbedingungen für die chemische Diffusion konstruieren, und (ii) der sechseckigen Zellkulturregion die aus 109 miteinander verbundenen sechseckigen und 24 halbsechseckigen Kammern in der Mitte besteht, die einer Wabenstruktur ähneln. Der Chip ist 100 m tief. Medienkanäle und Zellkulturbereich sind mit kleinen Schlitzen (ca. 15 m Breit) verbunden, die einen direkten Medienfluss und die daraus resultierende Scherspannung im Zellkulturbereich verhindern und dennoch Chemikalien durch kleine Schlitze diffundieren und Nährstoffe austauschen können. Stoffwechselabfälle usw. Die Erzeugung chemischer Gradienten wird in Abbildung 1Bdargestellt, wo ein Medienkanal 0,1 mM Fluorescein enthält, während der andere Kanal frei von Fluorescein ist. Die Zellen werden auf einer gasdurchlässigen Membran kultiviert, die durch die Mikrostrukturen durch den positiven Gegendruck auf die Membran gegen den Chip eingekapselt wird. Die Komponenten des Gerätehalters sind in Abbildung 2dargestellt, und der Versuchsaufbau ist in Abbildung 3dargestellt, wo die Kultur auf einem invertierten Mikroskop bei 37 °C, mit über 85 % relativer Luftfeuchtigkeit, gepflegt und unter Normoxia-Gaszusammensetzung.
Dieses System bietet eine detaillierte Beobachtung lokalisierter zellulärer Wechselwirkungen über Hellfeld- und Fluoreszenzkanäle und ermöglicht räumlich aufgelöste downstream Assays wie Immunfluoreszenz, Western Blot oder Massenspektrometrie. Wir haben zuvor als Proof-of-Prinzip dieses mikrofluidischen Krebs-on-Chip-Modells auf die langfristige Co-Kultur von epitheliale und mesenchymalePC3 Prostatakrebszellen12 sowie die Entstehung von drogenresistenten polyploiden Riesen Krebszellen mit der epitheliale PC3-Zelllinie13. Während wir die Anwendung dieser Plattform präsentieren, um die raumzeitliche Dynamik von epitheliaalen PC3- und mesenchymalen Prostatakrebszellen unter einem Spannungsgradienten von Docetaxel zu verstehen, kann das mikrofluidische System leicht auf eine beliebige Kombination von Zelllinien angewendet werden. Ressourcen (d. h. Drogen, Nährstoffe, Sauerstoff) Gradienten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konventionelle Zellkultur wurde vor fast einem Jahrhundert entwickelt und bleibt das am häufigsten verwendete präklinische Modell in der biomedizinischen Forschung, trotz seiner nachgewiesenen begrenzten Fähigkeit, klinische Ergebnisse bei Krebs vorherzusagen17. Tiermodelle bieten die höchste physiologische Relevanz und vernünftige genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen, aber seit langem anerkannt, dass erhebliche Einschränkungen bei der Vorhersage menschlicher Ergebnisse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NSF PHY-1659940 unterstützt.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
Riferimenti
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