הדור של מעברי מדרגות של סמים הטרוגנית ברחבי אוכלוסיות סרטן על מאיץ האבולוציה Microfluidic להתבוננות בזמן אמת
Summary
אנו מציגים מודל סרטן על שבב מיקרופלואידים, הטכנולוגיה “מאיץ האבולוציה”, אשר מספק פלטפורמה לשליטה לטווח ארוך בזמן אמת מחקרים כמותיים של הדינמיקה של סרטן בתנאים סביבתיים המוגדרים היטב בתא יחיד רמת. טכנולוגיה זו צפויה לעבוד כמודל מבחנה עבור מחקר בסיסי או פיתוח תרופות טרום-קליני.
Abstract
תרבות התא קונבנציונאלי נשאר מודל טרום קליני בשימוש תכוף, למרות היכולת המוגבלת שלה מוכחת לחזות תוצאות קליניות בסרטן. סרטן מיקרופלואידיג-על שבב מודלים כבר הציעו לגשר על הפער בין תרבויות 2D קונבנציונאלי מסובכים יותר מודלים בעלי חיים מורכבים יותר, אשר יש יכולת מוגבלת לייצר תוצאות כמותיים אמין ומחורץ. כאן, אנו מציגים מודל מיקרופלואידיג סרטן על שבב שמתרבה רכיבים מרכזיים של מיקרוסביבה מורכבת הגידול באופן מקיף, עדיין הוא פשוט מספיק כדי לספק תיאורים כמותיים חזקים של הדינמיקה של סרטן. זה סרטן מיקרופלואידיג מודל על שבב, “המאיץ האבולוציה,” מפרק את האוכלוסייה הגדולה של תאים סרטניים לתוך מערך מחובר של מיקרוסביבות הגידול תוך יצירת מתחים הטרוגנית כימותרפיה. ההתקדמות ואת הדינמיקה האבולוציונית של סרטן בתגובה מעבר הצבע התרופה יכול להיות מנוטר במשך שבועות בזמן אמת, וניסויים רבים במורד הזרם ניתן לבצע משלים את התמונות בזמן הקפיצה שנלקחו במהלך הניסויים.
Introduction
סרטן כבר הוכר יותר ויותר כמערכת אקולוגית מורכבת, כי תלוי לא רק על המשך בלתי מתמשך של אוכלוסיות תאים מוטציה אלא גם על אינטראקציות חיוניות בין תאים סרטניים לבין מיקרואקולוגיה המארחת. במובן זה, הסרטן מתפתח על נוף אדפטיבית המתבטא על ידי שילוב של גורמים, כולל מיקרוסביבה גידול הטרוגנית והוצלב עם מגוון של תאים מארחים, כולם לתרום לחצים סלקטיבית עבור גנטי נוסף או . שינויים אפיגנטיים1,2,3 בהקשר של גידולים מוצקים, התפלגות אחידה של chemotherapeutics ומעברי צבע אחרים התורמים לטרוגניות המולקולריים שלהם ועשויים לשחק תפקיד בפיתוח התנגדות לסמים, הגדילה אנגיוגנזה לגידול מסוים אוכלוסיות משנה, ואפילו גרורות4,5,6. קונבנציונאלי בלימודי תרבות תא 2D, תוך שליטה בקנה מידה גדול, היכולת ניסיוני נוח, מספק שדה ממוצע, אחיד, וקבוע התנאים, לעתים קרובות חסר בקרת הסביבה המרחבית מדויק הזמני הדרושים באמת לחקות הדינמיקה הגידול vivo. כך, יש צורך יותר מודלים לשעבר vivo ex לשכפל את מיקרוסביבה הגידול לפני מודלים בעלי חיים בצינור פיתוח התרופה כדי חיזוי טוב יותר של התקדמות הסרטן, כמו גם תגובות סמים בתוך מתח דינמיות נופים. מיקרופלואידיקה הוצעו לגשר על הפער בין לימודי תרבות תא 2d ומורכבות יותר במחקרים בעלי חיים vivo שייתכן שלא יוכלו לתמוך במחקרים כמותיים שניתן לשליטה7,8,9.
אידיאלי במערכת מבחנה כדי לאפיין את הדינמיקה תאים סרטניים צריך להחזיק את היכולת ליצור מיקרוסביבה הטרוגנית כדי לחקות את התגובות הסלולר אדפטיבית שעשוי להתרחש בגידול, כמו גם לאפשר התבוננות של הדינמיקה הזאת ב רזולוציה של תא בודד. במאמר זה, אנו מתארים פלטפורמת מיקרופלואידיג תא התרבות, מכשיר מבוסס PDMS שנקרא “מאיץ האבולוציה” (EA), המאפשר מקבילים במחקרים מחוץ לגופית של דינמיקה תא סרטן ברזולוציה התאית עם רכישת נתונים בזמן אמת על משך שבועות, בעוד שמירה על מעברי מדרגות של מתח ברחבי הנוף התרבותי. העיצוב של פלטפורמה זו מתבסס על עבודתנו הקודמת, שבה ניתן להאיץ את הדינמיקה ההתפתחותית של אורגניזמים במטא-מטאפיסיה10,11. באופן ספציפי, בקבוצה של אוכלוסיות מופרדות הדדית האינטראקציה ברמה מסוימת, כאשר נחשפים לנוף הטרוגנית הלחץ, המינים המתאימים ביותר יכול להשתלט על האוכלוסייה המקומית מהר יותר לעומת זאת של אוכלוסיה גדולה אחידה. לאחר מכן, המינים הכדניים עוברים לבתי גידול שכנים בחיפוש אחר משאבים ומרחב, ובסופו של דבר שולטים באוכלוסיה כולה. כפי שמוצג באיור 1, התבנית של שבב EA microflu, מורכב (i) זוג של ערוצי הסרפנטיין המספקים מחזור מדיה טרי ולבנות תנאי גבול קבוע לדיפוזיה כימית, ו (ii) האזור תרבות התא משושה אשר מורכב 109 משושה המחוברים ו 24 חדרי חצי משושה במרכז, דמוי המבנה חלת דבש. השבב הוא 100 יקרומטר לעומק. ערוצי מדיה ואזור תרבות התא מקושרים עם חריצים קטנים (כ-15 יקרומטר רחב), אשר מונעים זרימת מדיה ישירה ומתח ההטיה כתוצאה מעבר לאזור התרבות של התא, ועדיין מאפשרים לכימיקלים לפזר באמצעות חריצים קטנים וחומרים מזינים של החליפין, פסולת מטבולית, וכו ‘. הדור של מעברי צבע כימיים מוצג באיור 1B, שבו ערוץ מדיה אחד מכיל 0.1 מ”מ של fluorescein בעוד הערוץ השני הוא חינם של fluorescein. תאים הם מתורבתים על ממברנה חדיר גז, כאשר כחלחל על ידי המיקרו מבנים דרך לחץ האחורי חיובי על הקרום נגד השבב. מרכיבי בעל ההתקן מומחשים באיור 2, והכיוונון הנסיוני מומחש באיור 3, כאשר התרבות נשמרת על מיקרוסקופ הפוך ב-37 ° c, עם מעל 85% לחות יחסית, וממוזג תחת הרכב גז נורמוסקסיה.
מערכת זו מספקת תצפית מפורטת של אינטראקציות הסלולר המותאמות לשפות אחרות באמצעות שדות פלורסנט ומאפשר העברה של הזרם החוצה, כגון immunofluorescence, אבן חשופה מערבית או ספקטרומטר מסה. הדגמנו בעבר כהוכחה של העיקרון של סרטן זה microflu, מודל על שבב של המודל על שיתוף לטווח ארוך של האפיתל ואת mesenchymal PC3 סרטן הערמונית תאים12 , כמו גם הופעתה של ענק סמים התנגדות פוליפואיד ענקית תאים סרטניים באמצעות האפיתל PC3 תא קו13. בעוד אנו מציגים את היישום של הפלטפורמה הזאת כדי להבין את הדינמיקה הטמפורלית של האפיתל PC3 ו mesenchymal סרטן הערמונית תאים תחת הדרגתי לחץ של doceel, מערכת microfluidic ניתן להחיל בקלות על כל שילוב של קווי התא ומשאבים (כלומר, תרופות, מזינים, חמצן) מעברי צבע.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרבות התא קונבנציונאלי פותחה כמעט לפני מאה שנה והוא נשאר המודל הנפוץ ביותר טרום קלינית במחקר ביו, למרות היכולת המוגבלת שלה מוכחת לחזות תוצאות קליניות סרטן17. דגמי בעלי חיים מציעים את הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר והדמיון הגנטי הסביר לבני האדם, אך זמן רב הכירו במגבלות מש…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
