वास्तविक समय अवलोकन के लिए एक Microfluidic विकास त्वरक पर कैंसर आबादी के पार Heterogeneous दवा gradients की पीढ़ी
Summary
हम एक microfluidic कैंसर पर चिप मॉडल, “विकास त्वरक” प्रौद्योगिकी है, जो एक सेल में अच्छी तरह से परिभाषित पर्यावरण की स्थिति के भीतर कैंसर गतिशीलता के दीर्घकालिक वास्तविक समय मात्रात्मक अध्ययन के लिए एक नियंत्रणीय मंच प्रदान करता है प्रस्तुत स्तर. इस प्रौद्योगिकी के लिए मौलिक अनुसंधान या पूर्व नैदानिक दवा विकास के लिए एक इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करने की उम्मीद है.
Abstract
पारंपरिक सेल संस्कृति सबसे अक्सर इस्तेमाल किया पूर्व नैदानिक मॉडल रहता है, इसके सिद्ध सीमित करने के लिए कैंसर में नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी करने की क्षमता के बावजूद. Microfluidic कैंसर पर चिप मॉडल oversimplified पारंपरिक 2 डी संस्कृतियों और अधिक जटिल पशु मॉडल है, जो विश्वसनीय और reproduible मात्रात्मक परिणाम का उत्पादन करने की क्षमता सीमित है के बीच अंतर को पाटने का प्रस्ताव किया गया है. यहाँ, हम एक microfluidic कैंसर पर चिप मॉडल है कि एक व्यापक तरीके से एक जटिल ट्यूमर microenvironment के प्रमुख घटकों को पुन: पेश प्रस्तुत है, अभी तक काफी सरल कैंसर गतिशीलता के मजबूत मात्रात्मक विवरण प्रदान करने के लिए है. इस microfluidic कैंसर पर चिप मॉडल, “विकास त्वरक,” ट्यूमर microenvironments के एक परस्पर सरणी में कैंसर की कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी टूट जाता है, जबकि एक विषम chemotherapetic तनाव परिदृश्य पैदा. दवा ढाल के जवाब में प्रगति और कैंसर के विकासवादी गतिशीलता वास्तविक समय में सप्ताह के लिए नजर रखी जा सकती है, और कई downstream प्रयोगों के दौरान लिया समय चूक छवियों के लिए पूरक प्रदर्शन किया जा सकता है.
Introduction
कैंसर तेजी से एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र है कि न केवल उत्परिवर्तित सेल आबादी के निरंतर dysgation पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी कैंसर कोशिकाओं और मेजबान microenvironment के बीच महत्वपूर्ण बातचीत पर निर्भर करता है के रूप में मान्यता प्राप्त किया गया है. इस अर्थ में, कैंसर एक अनुकूली परिदृश्य पर विकसित कारकों का एक संयोजन द्वारा प्रकट, मेजबान कोशिकाओं की एक किस्म के साथ एक विषम ट्यूमर microenvironment और crosstalk सहित, जिनमें से सभी आगे आनुवंशिक या के लिए चयनात्मक दबाव योगदान एपिजेनेटिक परिवर्तन1,2,3. ठोस ट्यूमर के संदर्भ में, कीमोथेरपी और अन्य संसाधन ग्रेडिएंटका असमान वितरण उनकी आणविक विषमता में योगदान देता है और दवा प्रतिरोध के विकास में एक भूमिका निभा सकता है, विशेष ट्यूमर के लिए एंजियोजेनेसिस में वृद्धि हुई है उपजनसंख्या, और यहां तक कि मेटास्टेसिस4,5,6. पारंपरिक इन विट्रो 2 डी सेल संस्कृति अध्ययन, जबकि बड़े पैमाने पर, सुविधाजनक प्रयोगात्मक क्षमता रखने, मतलब क्षेत्र, वर्दी, और निश्चित शर्तों प्रदान करता है, अक्सर सटीक स्थानिक और लौकिक पर्यावरण नियंत्रण वास्तव में करने के लिए आवश्यक कमी विवो ट्यूमर गतिशीलता में अनुकरण। इस प्रकार, वहाँ और अधिक प्रतिनिधि पूर्व vivo मॉडल के लिए एक की जरूरत है ट्यूमर microenvironment दवा विकास पाइप लाइन में पशु मॉडल से पहले पुन: पेश करने के लिए आदेश में कैंसर प्रगति का एक बेहतर भविष्यवाणी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गतिशील तनाव के भीतर दवाओं के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए परिदृश्य. माइक्रोफ्लूइडिक्स को 2 डी सेल कल्चर स्टडीज और विवो जानवरों के अध्ययनों में अधिक जटिल के बीच के अंतर को पाटने का प्रस्ताव किया गया है जो नियंत्रणीय मात्रात्मक अध्ययन7,8,9का समर्थन करने में सक्षम नहीं हो सकता है .
कैंसर सेल गतिशीलता की विशेषता के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक आदर्श अनुकूली सेलुलर प्रतिक्रियाओं है कि एक ट्यूमर में जगह ले सकता है नकल करने के लिए एक विषम microenvironment उत्पन्न करने की क्षमता के अधिकारी होना चाहिए, साथ ही एक पर इन गतिशीलता के अवलोकन के लिए अनुमति देते हैं एकल सेल संकल्प. इस अनुच्छेद में, हम एक microfluidic सेल संस्कृति मंच का वर्णन, एक PDMS आधारित डिवाइस बुलाया “विकास त्वरक” (EA), कि पर वास्तविक समय डेटा अधिग्रहण के साथ सेलुलर संकल्प पर कैंसर सेल गतिशीलता के समानांतर इन विट्रो अध्ययन के लिए अनुमति देता है सप्ताह के दौरान, जबकि संस्कृति परिदृश्य भर में तनाव की ढाल को बनाए रखने stably. इस मंच का डिजाइन हमारे पिछले काम पर आधारित है , जिसमें एक मेटापॉपुलेशन में जीवों की विकासवादी गतिशीलता को10,11में त्वरित किया जा सकता है . विशेष रूप से, स्थानिक रूप से अलग आबादी के एक समूह में है कि कुछ स्तर पर बातचीत, जब एक विषम तनाव परिदृश्य के संपर्क में, सबसे फिट प्रजातियों एक स्थानीय आबादी में तेजी से एक बड़ी वर्दी आबादी की तुलना में हावी कर सकते हैं. लाभप्रद प्रजातियों तो संसाधनों और अंतरिक्ष की तलाश में पड़ोसी microhabitats के लिए पलायन, और अंत में पूरी आबादी पर हावी है. जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है , माइक्रोफ्लूइडिक ईए चिप का पैटर्न (i) सर्पाकार चैनलों की एक जोड़ी से बना है जो नए सिरे से मीडिया परिसंचरण प्रदान करता है और रासायनिक प्रसार के लिए निश्चित सीमा शर्तों का निर्माण करता है, और (पप) हेक्सागोनल कोशिका संस्कृति क्षेत्र जिसमें मध्य में 109 परस्पर हेक्सागोनल और 24 अर्ध-हेक्सागोनल कक्ष होते हैं, जो एक मधुकोश संरचना के समान होते हैं। चिप की गहराई 100 डिग्री है। मीडिया चैनलों और सेल संस्कृति क्षेत्र छोटे slits के साथ जुड़े हुए हैं (के बारे में 15 डिग्री मीटर चौड़ा), जो प्रत्यक्ष मीडिया प्रवाह और सेल संस्कृति क्षेत्र भर में जिसके परिणामस्वरूप कतरनी तनाव को रोकने, अभी तक अभी भी रसायनों छोटे slits और विनिमय पोषक तत्वों के माध्यम से फैलाना करने के लिए अनुमति देते हैं, चयापचय अपशिष्ट, आदि चित्र 1खमें रासायनिक प्रवणता का प्रदर्शन किया गया है, जहाँ एक मीडिया चैनल में 0ण्1 उ फ्लोरेसीन होता है जबकि दूसरा चैनल फ्लोरेसीन से मुक्त होता है। कोशिकाओं को एक गैस पारगम्य झिल्ली पर सुसंस्कृत कर रहे हैं, चिप के खिलाफ झिल्ली पर सकारात्मक पीठ दबाव के माध्यम से microstructures द्वारा encapsulate. युक्ति धारक के घटकोंको चित्र 2 में सचित्र में दिखाया गया है और प्रायोगिक सेटअप चित्र 3में सचित्र है , जहाँ संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिलोमित सूक्ष्मदर्शी पर रखा जाता है, जिसकी सापेक्ष आर्द्रता 85% सापेक्ष आर्द्रता से ऊपर होती है और इसके नीचे सशर्त ाअसा जाता है. नॉर्मक्सिया गैस संरचना.
इस प्रणाली के उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट चैनलों के माध्यम से स्थानीयकृत सेलुलर बातचीत की विस्तृत अवलोकन प्रदान करता है और इस तरह के इम्यूनोफ्लोरेसींस, पश्चिमी धब्बा, या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में स्थानिक रूप से हल बहाव परख के लिए अनुमति देता है। हम पहले इस microfluidic कैंसर के एक सबूत के सिद्धांत के रूप में प्रदर्शन किया है पर चिप मॉडल लंबी अवधि के उप-संस्कृति उपकला और mesenchymal PC3 प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं12 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दवा प्रतिरोध बहुगुणित giantloid के उद्भव पर कैंसर कोशिकाओं उपकला पीसी 3 सेल लाइन13का उपयोग कर . जबकि हम इस मंच के आवेदन प्रस्तुत उपकला PC3 और mesenchymal प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के spatiotemporal गतिशीलता docetaxel के एक तनाव ढाल के तहत समझने के लिए, microfluidic प्रणाली आसानी से सेल लाइनों के किसी भी संयोजन के लिए लागू किया जा सकता है और संसाधन (यानी, दवा, पोषक तत्व, ऑक्सीजन) ग्रेडिएंट।
Protocol
Representative Results
Discussion
पारंपरिक सेल संस्कृति लगभग एक सदी पहले विकसित किया गया था और जैव चिकित्सा अनुसंधान में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया पूर्व नैदानिक मॉडल बनी हुई है, इसके सिद्ध सीमित करने के लिए कैंसर में नैदानिक परिणामों क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य एनएसएफ पीएचई-1659940 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
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