リアルタイム観察のためのマイクロ流体進化加速器上の癌集団全体にわたる異種薬物勾配の生成
Summary
マイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」技術を提示し、単一細胞における明確な環境条件下でがんダイナミクスを長期リアルタイムで定量的に研究するための制御可能なプラットフォームを提供します。レベル。この技術は、基礎研究や前臨床薬開発のためのインビトロモデルとしての働きが期待されます。
Abstract
従来の細胞培養は、がんの臨床結果を予測する能力が限られているにもかかわらず、最も頻繁に使用される前臨床モデルのままである。マイクロ流体がんオンチップモデルは、過度に単純化された従来の2D培養と、信頼性が高く再現可能な定量的結果を生み出す能力が限られている、より複雑な動物モデルとの間のギャップを埋めるために提案されている。ここでは、複雑な腫瘍微小環境の主要成分を包括的に再現するマイクロ流体がんオンチップモデルを紹介しますが、がんダイナミクスの堅牢な定量的記述を提供するのに十分簡単です。このマイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」は、がん細胞の大量を相互接続された腫瘍微小環境に分解し、異種化学療法ストレスランドスケープを生成します。薬物勾配に応答する癌の進行と進化的ダイナミクスは、リアルタイムで数週間監視することができ、多数の下流実験は、実験の過程で撮影されたタイムラプス画像を補完して行うことができます。
Introduction
がんは、変異細胞集団の継続的な調節不全だけでなく、癌細胞と宿主の微小環境との間の重要な相互作用にも依存する複雑な生態系としてますます認識されています。この意味で、癌は、異種腫瘍微小環境および様々な宿主細胞とのクロストークを含む要因の組み合わせによって現れる適応的な風景に進化し、そのすべてがさらなる遺伝的またはエピジェネティックな変化1,2,3.固形腫瘍の文脈では、化学療法および他の資源勾配の不均一な分布は、その分子不均一性に寄与し、薬剤耐性の開発に役割を果たし、特定の腫瘍に対する血管新生の増加を果たすかもしれない亜集団、さらには転移4、5、6.従来のインビトロ2D細胞培養研究は、大規模で便利な実験能力を有する一方で、平均分野、均一、固定条件を提供し、多くの場合、真に必要な正確な空間的および時間的な環境制御を欠いている。生体内腫瘍ダイナミクスをエミュレートします。したがって、がんの進行をより良く予測し、動的ストレス内の薬物に対する応答を改善するために、薬剤開発パイプラインにおける動物モデルの前に腫瘍微小環境を再現するために、より代表的なex vivoモデルが必要とされています。風景。マイクロ流体学は、制御可能な定量的研究7、8、9をサポートすることができないかもしれない生体内動物研究における2D細胞培養研究とより複雑な間のギャップを埋めるために提案されている。
がん細胞のダイナミクスを特徴付ける理想的なインビトロシステムは、腫瘍で起こり得る適応細胞応答を模倣する不均一な微小環境を生成する能力を有し、また、単一セル解像度。本稿では、細胞分解能におけるがん細胞ダイナミクスのインビトロ研究を可能にするPDMSベースのデバイスであるマイクロ流体細胞培養プラットフォームについて、リアルタイムのデータ取得を用いて細胞分解能を用いて説明する。文化景観全体のストレスの勾配を安定的に維持しながら、数週間のコース。このプラットフォームの設計は、メタ集団における生物の進化的ダイナミクスを加速することができる我々の前の研究に基づいています10,11.具体的には、あるレベルで相互作用する空間的に分離された集団のグループでは、異種ストレス景観にさらされると、最も適合する種は、大規模な均一集団のそれと比較して、より速く地元の集団で支配することができます。有利な種は、資源と空間を求めて近隣の微生物生息地に移動し、最終的には全人口を支配する。図1に示すように、マイクロ流体EAチップのパターンは、(i)新鮮な媒体循環を提供し、化学拡散のための固定境界条件を構築する一対の蛇行チャネル、および(ii)六角形細胞培養領域で構成される。これは、ハニカム構造に似て、中央に109の相互接続された六角形と24の半六角形の部屋で構成されています。チップの深さは100μmです。培地チャネルと細胞培養領域は、小さなスリット(幅約15μm)と接続されており、直接の培地の流れを防ぎ、細胞培養領域全体で生じるせん断応力を防ぎますが、それでも化学物質が小さなスリットを通して拡散し、栄養素を交換することができます。代謝廃棄物等化学勾配の生成は図1Bで示され、一方のメディアチャネルには0.1 mMのフルオレセインが含まれ、もう一方のチャネルにはフルオレセインが含まれな場合があります。細胞はガス透過性膜上で培養され、チップに対する膜上の正の背圧を介して微細構造によって封入される。デバイスホルダーの構成要素を図2に示し、実験セットアップを図3に示し、培養は37°Cの反転顕微鏡で維持され、85%以上の相対湿度で、条件付けされています。ノルモキシアガス組成物。
このシステムは、ブライトフィールドおよび蛍光チャネルを介して局所的な細胞相互作用の詳細な観察を提供し、免疫蛍光、ウェスタンブロット、質量分析などの空間的に分解された下流アッセイを可能にします。我々は、上皮および間葉系PC3前立腺癌細胞12の長期共培養および薬剤耐性ポリプロイド巨人の出現に関するこのマイクロ流体癌オンチップモデルの原理の証明として以前に実証した。上皮PC3細胞株13を用いて癌細胞。このプラットフォームの応用は、上皮PC3とドセタキセルのストレス勾配下での間葉前立腺癌細胞の時空間的ダイナミクスを理解するために提示するが、マイクロ流体系は細胞株の任意の組み合わせに容易に適用することができる。およびリソース(すなわち、薬物、栄養素、酸素)勾配。
Protocol
Representative Results
Discussion
従来の細胞培養はほぼ1世紀前に開発され、がん17の臨床結果を予測する実証済みの限られた能力にもかかわらず、生物医学研究で最も頻繁に使用される前臨床モデルのままである。動物モデルは、ヒトに対して最も高い生理学的関連性と合理的な遺伝的類似性を提供するが、ヒトの結果を予測する上で重要な限界があることを長い間認められてきた18。す?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業はNSF PHY-1659940によってサポートされました。
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
Riferimenti
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