실시간 관찰을 위한 미세 유체 진화 가속기에 암 인구에 걸쳐 이기종 약물 그라데이션의 생성
Summary
우리는 단일 세포에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기 실시간 정량 적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공하는 미세 유체 암 온 칩 모델인 “Evolution Accelerator” 기술을 제시합니다. 수준. 이 기술은 근본적인 연구 또는 전임상 신약 개발을 위한 시험관 내 모델로 작동할 것으로 예상됩니다.
Abstract
기존의 세포 배양은 암에서 임상 결과를 예측하는 입증된 제한된 능력에도 불구하고 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있습니다. 미세 유체 암 온 칩 모델은 지나치게 단순화된 기존의 2D 배양과 보다 복잡한 동물 모델 사이의 격차를 해소하기 위해 제안되었으며, 이는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 결과를 생성하는 능력이 제한적입니다. 여기에서, 우리는 포괄적인 방식으로 복잡한 종양 미세 환경의 중요한 분대를 재현하는 microfluidic 암 온 칩 모형을 제시하고, 그러나 암 역학의 강력한 양적 설명을 제공하기 위하여 충분히 간단합니다. 이 미세 유체 암 온 칩 모델, “진화 가속기,” 이질적인 화학 요법 스트레스 풍경을 생성 하는 동안 종양 미세 환경의 상호 연결 된 배열으로 암 세포의 큰 인구를 분해. 약물 구배에 반응하는 암의 진행 및 진화 역학은 몇 주 동안 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 수많은 다운스트림 실험은 실험 과정을 통해 촬영된 시간 경과 이미지에 상보적으로 수행될 수 있다.
Introduction
암은 돌연변이 된 세포 집단의 지속적인 dysregulation뿐만 아니라 암세포와 숙주 미세 환경 사이의 중요한 상호 작용에 의존하는 복잡한 생태계로 점점 인식되고 있습니다. 이러한 의미에서, 암은 다양한 숙주 세포와의 이기종 종양 미세 환경 및 누화를 포함한 요인의 조합에 의해 나타나는 적응형 풍경에서 진화하며, 이 모두는 추가 유전적 또는 또는 후성 유전학 변경1,2,3. 고형 종양의 맥락에서, 화학요법 및 그밖 자원 구배의 고르지 않은 분포는 그들의 분자 이질성에 기여하고 약 저항의 발달에 있는 역할을 할 수 있습니다, 특정 종양에 증가한 혈관 신생 하위 인구, 심지어 전이4,5,6. 기존의 시험관 내 2D 세포 배양 연구는 대규모의 편리한 실험 능력을 유지하면서 평균 필드, 균일 및 고정 조건을 제공하며, 종종 진정으로 필요한 정확한 공간 및 시간적 환경 제어가 부족합니다. 생체 내 종양 역학에 에뮬레이트합니다. 따라서, 역학 적 스트레스 내에서 약물에 대한 반응뿐만 아니라 암 진행의 더 나은 예측을 위해 약물 개발 파이프 라인에서 동물 모델 이전에 종양 미세 환경을 재현하는 보다 대표적인 ex vivo 모델에 대한 필요성이 있다. 풍경. 미세유체학은 제어 가능한 정량적연구를지원하지 못할 수 있는 2D 세포 배양 연구와 보다 복잡한 생체내 동물 연구 사이의 격차를 해소하기 위해7,8,9로제안되었다.
암 세포 역학을 특성화하는 이상적인 시험관 내 시스템은 종양에서 일어날 수 있는 적응형 세포 반응을 모방하는 이기종 미세 환경을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 역학의 관찰을 허용해야 합니다. 단일 셀 해상도. 이 기사에서는, 우리는 미세 유체 세포 배양 플랫폼, “진화 가속기”라는 PDMS 기반 장치를 설명 (EA), 즉 세포 해상도에서 암 세포 역학의 병렬 체외 연구를 허용 하는 실시간 데이터 수집 몇 주 동안, 문화 풍경에 걸쳐 스트레스의 그라데이션을 안정적으로 유지하면서. 이 플랫폼의 디자인은 메타 인구에서 유기체의 진화 역학을10,11가속화 할 수있는 우리의 이전 작업을 기반으로합니다. 특히, 공간적으로 분리된 집단의 그룹에서 어느 정도 상호작용하는 이질적인 응력 풍경에 노출될 때, 가장 적합한 종은 큰 균일한 집단에 비해 지역 집단에서 더 빨리 지배할 수 있다. 유리한 종은 자원과 공간을 찾기 위해 이웃 의 미생물 서식지로 이동하고, 결국 전체 인구를 지배. 도 1에도시된 바와 같이, 미세유체 EA 칩의 패턴은 (i) 한 쌍의 서펜타인 채널로 구성되어 신선한 배지 순환을 제공하고 화학적 확산을 위한 고정 경계 조건을 구성하고, (ii) 육각형 세포 배양 영역을 구성한다. 109 개의 상호 연결된 육각형 과 24 개의 반 육각 형 챔버가 중앙에 들어 있으며 벌집 구조를 닮았습니다. 칩의 깊이는 100 μm입니다. 미디어 채널 및 세포 배양 영역은 작은 슬릿 (약 15 μm 폭)과 연결되어 직접 적인 배지 흐름과 세포 배양 영역 전반에 걸친 전단 응을 방지하면서도 화학 물질이 작은 슬릿을 통해 확산되고 영양소를 교환 할 수 있습니다. 신진 대사 폐기물 등 화학 그라데이션의 생성은 한 매체 채널이 플루오레세인의 0.1 mM을 포함하고 다른 채널에는 불소가 없는 경우 그림 1B에서입증됩니다. 세포는 가스 투과성 멤브레인상에서 배양되고, 칩에 대한 멤브레인에 대한 양압을 통해 미세 구조에 의해 캡슐화된다. 장치 홀더의 구성 요소는 그림 2에도시되어 있으며, 실험 설정은 도 3에도시되어 있으며, 여기서 배양은 37 °C의 반전된 현미경상에서 유지되고, 상대 습도가 85% 이상이며, 아래 조건부로 조절됩니다. 노르목시아 가스 조성.
이 시스템은 브라이트필드 및 형광 채널을 통해 국부적인 세포 상호 작용에 대한 상세한 관찰을 제공하며 면역 형광, 웨스턴 블롯 또는 질량 분석과 같은 공간적으로 해결된 하류 분석법을 허용합니다. 우리는 이전에 상피 및 중간엽 PC3 전립선 암 세포(12)의 장기 공동 배양뿐만 아니라 약물 내성 폴리 플로이드 거인의 출현에 대한 이 미세 유체 암 온 칩 모델의 원리 증명으로 입증되었습니다. 상피 PC3세포주(13)를이용한 암세포. 우리는 도세탁셀의 스트레스 구배하에서 상피 PC3 및 중간엽 전립선 암 세포의 시공간 역학을 이해하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램을 제시하는 동안, 미세 유체 시스템은 세포주 조합의 모든 조합에 쉽게 적용 될 수있다 및 자원 (즉, 약물, 영양소, 산소) 그라데이션.
Protocol
Representative Results
Discussion
종래의 세포 배양은 거의 100년 전에 개발되었으며, 암17에서임상 결과를 예측하는 능력이 제한적이라는 입증된 능력에도 불구하고 생물의학 연구에서 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있다. 동물 모델은 인간에게 가장 높은 생리학적 관련성 및 합리적인 유전적 유사성을 제공하지만, 인간의 결과를 예측하는 데 상당한 한계가 있다고 오랫동안 인정되어 왔다<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NSF PHY-1659940에 의해 지원되었다.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
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