Generering av heterogene Drug graderinger på tvers av kreft populasjoner på en Mikrovæskebasert Evolution Accelerator for Real-Time observasjon
Summary
Vi presenterer en mikrovæskebasert kreft-on-chip-modellen, “Evolution Accelerator”-teknologi, som gir en kontrollerbar plattform for langsiktig sanntids kvantitative studier av kreft dynamikk innenfor veldefinerte miljøforhold på én celle Nivå. Denne teknologien forventes å fungere som en in vitro-modell for fundamental forskning eller før-klinisk narkotika utvikling.
Abstract
Konvensjonell cellekultur er fortsatt den mest brukte prekliniske modellen, til tross for sin påvist begrenset evne til å forutsi kliniske resultater i kreft. Mikrovæskebasert Cancer-on-chip modeller har blitt foreslått å bygge bro mellom unyansert konvensjonelle 2D kulturer og mer kompliserte dyremodeller, som har begrenset evne til å produsere pålitelige og reproduserbar kvantitative resultater. Her presenterer vi en mikrovæskebasert kreft-on-chip modell som gjengir viktige komponenter i en kompleks svulst mikromiljøet på en helhetlig måte, men er enkel nok til å gi robuste kvantitative beskrivelser av kreft dynamikk. Dette mikrovæskebasert kreft-on-chip-modellen, den “Evolution Accelerator,” bryter ned en stor befolkning av kreftceller i en sammenhengende rekke tumor microenvironments mens generere en heterogen kjemoterapeutiske stress landskap. Progresjon og evolusjonære dynamikken i kreft som svar på narkotika gradering kan overvåkes i uker i sanntid, og mange nedstrøms eksperimenter kan utføres komplementære til tidsforløpbilder tatt gjennom løpet av eksperimentene.
Introduction
Kreft har blitt stadig mer anerkjent som et komplekst økosystem som avhenger ikke bare av den fortsatte feilregulering av mutert celle populasjoner, men også på vitale interaksjoner mellom kreftceller og verten mikromiljøet. I denne forstand utvikler kreft på en adaptiv landskapet manifestert ved en kombinasjon av faktorer, inkludert en heterogen tumor mikromiljøet og crosstalk med en rekke verts celler, som alle bidrar selektiv press for videre genetisk eller epigenetic endringer1,2,3. I sammenheng med solide svulster, bidrar ujevn fordeling av chemotherapeutics og andre ressurs graderinger til deres molekylære heterogenitet og kan spille en rolle i utviklingen av resistens, økt angiogenese til bestemte tumor subpopulasjoner, og selv metastasering4,5,6. Konvensjonelle in vitro 2D cellekultur studier, samtidig som besitter stor skala, praktisk eksperimentell kapasitet, gir middel felt, uniform, og faste forhold, ofte mangler den nøyaktige romlige og timelige miljøkontroll nødvendig for å virkelig etterligne in vivo tumor dynamikk. Således, det er en nød for flere Distinguished ex vivo modeller å avbilde det svulst mikromiljøet tidligere å dyr modeller inne stoffet utviklingen rørledning i orden for en bedre prediksjon av kreften progresjon likeledes idet Svar å medikamenter innen dynamiske trykk Landskap. Materialer har blitt foreslått å bygge bro over gapet mellom 2D cellekultur studier og mer komplekse in vivo dyrestudier som kanskje ikke kunne støtte kontrollerbar kvantitative studier7,8,9.
En ideell in vitro-system for å karakterisere kreftcelle dynamikk bør ha muligheten til å generere en heterogen mikromiljøet å etterligne den adaptive cellulære svar som kan skje i en svulst, samt tillate observasjon av disse dynamikken på en oppløsning med én celle. I denne artikkelen beskriver vi en mikrovæskebasert cellekultur plattform, en PDMS-basert enhet kalt “Evolution Accelerator” (EA), som tillater parallell in vitro studier av kreftcelle dynamikk ved mobilnettet oppløsning med sanntids datainnhenting over løpet av uker, mens stabilt opprettholde graderinger av stress over kulturlandskapet. Utformingen av denne plattformen er basert på vår tidligere arbeid, der evolusjonære dynamikken i organismer i en metapopulation kan bli akselerert10,11. Nærmere bestemt i en gruppe av romlig adskilte populasjoner som samhandler på et eller annet nivå, når de utsettes for en heterogen stress landskap, den mest passende arter kan dominere i en lokalbefolkning raskere sammenlignet med at en stor ensartet befolkning. Den fordelaktige arten deretter migrere til nabo microhabitats på leting etter ressurser og plass, og til slutt dominerer hele befolkningen. Som vist i figur 1, er mønsteret av mikrovæskebasert EA chip sammensatt av (i) et par Serpentine kanaler som gir fersk Media sirkulasjon og konstruere faste grensen forhold for kjemisk diffusjon, og (II) den sekskantede celle kulturen regionen som består 109 sammenhengende sekskantede og 24 halv-sekskantede kamre i sentrum, likner en honeycomb struktur. Brikken er 100 μm i dybden. Mediekanaler og cellekultur regionen er forbundet med små åpninger (ca 15 μm bred), som hindrer direkte Media flyt og den resulterende skjær stress over cellen kulturområdet, men likevel tillate kjemikalier til diffuse gjennom små åpninger og utveksle næringsstoffer, metabolsk avfall, etc. Generering av kjemiske graderinger er demonstrert i figur 1B, der én mediekanal inneholder 0,1 mm fluorescein mens den andre kanalen er fri for fluorescein. Cellene er kultivert på en gass gjennomtrengelig membran, innkapslet av mikrostrukturen gjennom det positive bakre trykket på membranen mot brikken. Komponentene i enhets holde ren er illustrert i figur 2, og det eksperimentelle oppsettet er illustrert i Figur 3, der kulturen opprettholdes på en invertert mikroskop ved 37 ° c, med over 85% relativ fuktighet, og betinget under normoxia gass sammensetning.
Dette systemet gir detaljert observasjon av lokaliserte cellulære interaksjoner via brightfield og fluorescerende kanaler og gir mulighet for romlig nedstrøms analyser som immunofluorescence, Western Blot, eller masse massespektrometri. Vi har tidligere demonstrert som en proof-of-prinsippet av denne mikrovæskebasert kreft-på-chip-modellen på lang sikt co-kulturen av epitel og mesenchymal PC3 prostata kreftceller12 samt fremveksten av narkotika-motstand polyploid giganten kreftceller ved hjelp av epitel PC3 cellelinje13. Mens vi presenterer anvendelsen av denne plattformen for å forstå den spatiotemporal dynamikken i epitel PC3 og mesenchymal prostata kreftceller under en stress gradering av docetaksel, kan mikrovæskebasert systemet enkelt brukes til en kombinasjon av cellelinjer og ressurs (dvs. narkotika, næringsstoffer, oksygen) graderinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konvensjonelle celle kulturen ble utviklet for nesten hundre år siden og er fortsatt den mest brukte prekliniske modellen i biomedisinsk forskning, til tross for sin påvist begrenset evne til å forutsi kliniske resultater i kreft17. Animal modeller tilbyr den høyeste fysiologiske relevans og rimelig genetisk likhet til mennesker, men har lenge vært anerkjent for å ha betydelige begrensninger i å forutsi menneskelige utfall18. Blant alle de eksisterende prekliniske mo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
