Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real
Summary
Nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta, a tecnologia do “acelerador evolução”, que fornece uma plataforma controlável para estudos quantitativos em tempo real a longo prazo da dinâmica do cancro dentro das condições ambientais bem definidas no único-Cell Nível. Espera-se que esta tecnologia funcione como um modelo in vitro para pesquisa fundamental ou desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.
Abstract
A cultura celular convencional continua sendo o modelo pré-clínico mais freqüentemente utilizado, apesar de sua comprovada capacidade limitada de prever resultados clínicos em câncer. Modelos de câncer microfluídico em chip têm sido propostos para colmatar a lacuna entre as culturas 2D convencionais supersimplificadas e modelos animais mais complicados, que têm capacidade limitada para produzir resultados quantitativos confiáveis e reprodutíveis. Aqui, nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta que reproduz componentes chaves de um microambiente complexo do tumor em uma maneira detalhada, contudo é simples bastante fornecer descrições quantitativas robustas da dinâmica do cancro. Este modelo microfluídico de câncer em chip, o “Evolution Accelerator”, divide uma grande população de células cancerosas em uma matriz interconectada de microambientes tumorais, gerando uma paisagem de estresse quimioterápico heterogêneo. A progressão e a dinâmica evolutiva do câncer em resposta ao gradiente de drogas podem ser monitoradas por semanas em tempo real, e inúmeros experimentos a jusante podem ser realizados de forma complementar às imagens de lapso de tempo tiradas no decorrer dos experimentos.
Introduction
O câncer tem sido cada vez mais reconhecido como um ecossistema complexo que depende não só da continuação da desregulação das populações de células mutadas, mas também de interações vitais entre as células cancerosas e o microambiente hospedeiro. Nesse sentido, o câncer evolui em uma paisagem adaptativa manifestada por uma combinação de fatores, incluindo um microambiente de tumor heterogêneo e conversa cruzada com uma variedade de células hospedeiras, todas as quais contribuem com pressões seletivas para mais genética ou alterações epigenéticas1,2,3. No contexto de tumores sólidos, a distribuição desigual de quimioterápicos e outros gradientes de recursos contribui para sua heterogeneidade molecular e pode desempenhar um papel no desenvolvimento da resistência a fármacos, aumento da angiogênese para o tumor particular subpopulações e até mesmo metástase4,5,6. Estudos de cultura de células 2D convencionais in vitro, possuindo capacidade experimental de grande escala e conveniente, proporcionam condições de campo médio, uniformes e fixas, muitas vezes faltando o controle ambiental preciso e espacial necessário para realmente emular a dinâmica tumoral in vivo. Assim, há a necessidade de modelos ex vivo mais representativos para reproduzir o microambiente tumoral antes dos modelos animais no pipeline de desenvolvimento de fármacos para uma melhor predição da progressão do câncer, bem como respostas a drogas dentro do estresse dinâmico Paisagens. Microfluínicos têm sido propostos para colmatar a lacuna entre estudos de cultura de células 2D e estudos em animais mais complexos in vivo que podem não ser capazes de suportar estudos quantitativos verificáveis7,8,9.
Um sistema in vitro ideal para caracterizar a dinâmica das células cancerosas deve possuir a capacidade de gerar um microambiente heterogêneo para imitar as respostas celulares adaptativas que podem ocorrer em um tumor, bem como permitir a observação dessas dinâmicas em um resolução de uma única célula. Neste artigo, descrevemos uma plataforma de cultura de células microfluídico, um dispositivo baseado em PDMS chamado “Evolution Accelerator” (EA), que permite estudos paralelos in vitro de dinâmicas de células cancerosas em resolução celular com aquisição de dados em tempo real sobre o curso de semanas, enquanto mantendo estavelmente gradientes de stress em toda a paisagem da cultura. O projeto desta plataforma é baseado em nosso trabalho precedente, em que a dinâmica evolutiva dos organismos em um metapopulação pode ser acelerada10,11. Especificamente, em um grupo de populações espacialmente separadas que interagem em algum nível, quando expostos a uma paisagem de estresse heterogêneo, as espécies mais aptos podem dominar em uma população local mais rapidamente em comparação com a de uma grande população uniforme. As espécies vantajosas então migram para os microhabitats vizinhos em busca de recursos e espaço, e eventualmente dominam toda a população. Como mostrado na Figura 1, o padrão do chip microfluídico ea é composto de (i) um par de canais serpentinos que fornecem circulação de mídia fresca e constroem condições de contorno fixo para difusão química, e (II) a região de cultura de células hexagonais que consiste em 109 câmaras sextavadas e 24 meio-hexagonais interconectadas no centro, assemelhando-se a uma estrutura alveolar. O chip é de 100 μm em profundidade. Os canais de mídia e a região da cultura celular estão conectados com pequenas fendas (cerca de 15 μm de largura), que impedem o fluxo direto de mídia e o estresse de cisalhamento resultante em toda a área de cultura celular, mas ainda permitem que os produtos químicos se difundem através de pequenas fendas e trocam nutrientes, resíduos metabólicos, etc. A geração de gradientes químicos é demonstrada na Figura 1B, onde um canal de mídia contém 0,1 mm de fluoresceina, enquanto o outro canal está livre de fluoresceina. As pilhas são cultivadas em uma membrana permeável do gás, encapsulada pelas microestruturas com a pressão traseira positiva na membrana de encontro à microplaqueta. Os componentes do suporte do dispositivo são ilustrados na Figura 2, e a configuração experimental é ilustrada na Figura 3, onde a cultura é mantida em um microscópio invertido a 37 ° c, com acima de 85% de umidade relativa, e condicionada composição do gás normóxia.
Este sistema fornece a observação detalhada de interações celulares localizadas através do brightfield e de canaletas fluorescentes e permite os ensaios a jusante espacialmente-resolvidos tais como a imunofluorescência, o borrão ocidental, ou a espectrometria maciça. Nós demonstramos previamente como uma prova–princípio deste modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta na cocultura a longo prazo de pilhas epithelial e mesenquimais do cancro da próstata PC312 assim como o emergence do gigante poliplóides da droga-resistência células cancerosas usando a linha celular PC3 epitelial13. Quando nós apresentamos a aplicação desta plataforma para compreender a dinâmica armazenamento de PC3 epithelial e de pilhas mesenquimais do cancro da próstata um inclinação do stress de docetaxel, o sistema microfluídicos pode facilmente ser aplicado a toda a combinação de linhas de pilha e recursos (i.e., drogas, nutrientes, oxigênio) gradientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A cultura celular convencional foi desenvolvida há quase um século e continua sendo o modelo pré-clínico mais freqüentemente utilizado na pesquisa biomédica, apesar de sua comprovada capacidade limitada de prever resultados clínicos no câncer17. Os modelos animais oferecem a maior relevância fisiológica e similaridade genética razoável para os seres humanos, mas há muito têm sido reconhecidos para ter limitações significativas na predição de resultados humanos18…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
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