Generación de gradientes de drogas heterogéneas en poblaciones de cáncer en un acelerador de evolución microfluídica para la observación en tiempo real
Summary
Presentamos un modelo microfluídico de cáncer en chip, la tecnología “Evolution Accelerator”, que proporciona una plataforma controlable para estudios cuantitativos a largo plazo en tiempo real de la dinámica del cáncer dentro de condiciones ambientales bien definidas en la sola célula Nivel. Se espera que esta tecnología funcione como modelo in vitro para la investigación fundamental o el desarrollo de fármacos preclínicos.
Abstract
El cultivo celular convencional sigue siendo el modelo preclínico más utilizado, a pesar de su probada capacidad limitada para predecir los resultados clínicos en el cáncer. Se han propuesto modelos microfluídicos contra el cáncer en chip para cerrar la brecha entre los cultivos 2D convencionales demasiado simplificados y los modelos animales más complicados, que tienen una capacidad limitada para producir resultados cuantitativos fiables y reproducibles. Aquí, presentamos un modelo microfluídico de cáncer en chip que reproduce los componentes clave de un microambiente tumoral complejo de una manera integral, pero es lo suficientemente simple como para proporcionar descripciones cuantitativas robustas de la dinámica del cáncer. Este modelo microfluídico de cáncer en chip, el “Acelerador de la Evolución”, descompone una gran población de células cancerosas en una matriz interconectada de microambientes tumorales mientras genera un paisaje heterogéneo de estrés quimioterapéutico. La progresión y la dinámica evolutiva del cáncer en respuesta al gradiente de drogas se pueden monitorear durante semanas en tiempo real, y numerosos experimentos aguas abajo se pueden realizar de forma complementaria a las imágenes de lapso de tiempo tomadas a lo largo de los experimentos.
Introduction
El cáncer ha sido cada vez más reconocido como un ecosistema complejo que depende no sólo de la continua desregulación de las poblaciones de células mutadas, sino también de las interacciones vitales entre las células cancerosas y el microambiente huésped. En este sentido, el cáncer evoluciona en un paisaje adaptativo manifestado por una combinación de factores, incluyendo un microambiente tumoral heterogéneo y una conversación cruzada con una variedad de células huésped, todas las cuales contribuyen a presiones selectivas para cambios epigenéticos1,2,3. En el contexto de tumores sólidos, la distribución desigual de quimioterapia y otros gradientes de recursos contribuye a su heterogeneidad molecular y puede desempeñar un papel en el desarrollo de la resistencia a los fármacos, el aumento de la angiogénesis a un tumor subpoblaciones, e incluso metástasis4,5,6. Los estudios convencionales de cultivo de células 2D in vitro, aunque poseen una capacidad experimental conveniente y a gran escala, proporcionan condiciones de campo medio, uniformes y fijas, a menudo carentes del control ambiental espacial y temporal preciso necesario para emular la dinámica tumoral in vivo. Por lo tanto, es necesario que los modelos ex vivo más representativos reproduzcan el microambiente tumoral antes de los modelos animales en el gasoducto de desarrollo de fármacos con el fin de una mejor predicción de la progresión del cáncer, así como respuestas a los fármacos dentro del estrés dinámico Paisajes. Se han propuesto microfluidos para cerrar la brecha entre los estudios de cultivo celular 2D y estudios en animales in vivo más complejos que pueden no ser capaces de soportar estudios cuantitativos controlables7,8,9.
Un sistema in vitro ideal para caracterizar la dinámica celular del cáncer debe poseer la capacidad de generar un microambiente heterogéneo para imitar las respuestas celulares adaptativas que pueden tener lugar en un tumor, así como permitir la observación de estas dinámicas en un resolución de una sola célula. En este artículo, describimos una plataforma de cultivo celular microfluídico, un dispositivo basado en PDMS llamado “Evolution Accelerator” (EA), que permite estudios in vitro paralelos de la dinámica celular del cáncer a resolución celular con la adquisición de datos en tiempo real semanas, manteniendo establemente gradientes de estrés en todo el paisaje cultural. El diseño de esta plataforma se basa en nuestro trabajo anterior, en el que la dinámica evolutiva de los organismos en una metapoblación se puede acelerar10,11. Específicamente, en un grupo de poblaciones separadas espacialmente que interactúan a algún nivel, cuando se exponen a un paisaje de estrés heterogéneo, las especies más adecuadas pueden dominar en una población local más rápido en comparación con la de una gran población uniforme. Las especies ventajosas emigran a los microhábitats vecinos en busca de recursos y espacio, y eventualmente dominan a toda la población. Como se muestra en la Figura 1, el patrón del chip microfluídico EA se compone de (i) un par de canales de serpentina que proporcionan una circulación de medios fresca y construyen condiciones límite fijas para la difusión química, y (ii) la región de cultivo celular hexagonal que consta de 109 cámaras hexagonales interconectadas y 24 cámaras semihexagonales en el centro, que se asemejan a una estructura de panal. El chip tiene una profundidad de 100 m. Los canales de medios y la región de cultivo celular están conectados con pequeñas hendiduras (alrededor de 15 m de ancho), que evitan el flujo directo de medios y la tensión de cizallamiento resultante en toda el área de cultivo celular, pero aún así permiten que los productos químicos se difundan a través de pequeñas rendijas e intercambien nutrientes, residuos metabólicos, etc. La generación de gradientes químicos se demuestra en la Figura 1B,donde un canal de medios contiene 0,1 mM de fluoresceína mientras que el otro canal está libre de fluoresceína. Las células se cultivan en una membrana permeable al gas, encapsulada por las microestructuras a través de la presión de retroceso positiva en la membrana contra el chip. Los componentes del soporte del dispositivo se ilustran en la Figura 2,y la configuración experimental se ilustra en la Figura 3,donde el cultivo se mantiene en un microscopio invertido a 37 oC, con una humedad relativa superior al 85% y acondicionado bajo composición de gas normoxia.
Este sistema proporciona una observación detallada de las interacciones celulares localizadas a través de canales fluorescentes y de campo brillante y permite ensayos aguas abajo resueltas espacialmente como inmunofluorescencia, mancha occidental o espectrometría de masas. Hemos demostrado anteriormente como una prueba de principio de este modelo microfluídico de cáncer en chip sobre el cocultivo a largo plazo de las células de cáncer de próstata PC3 epitelialymal12, así como la aparición del gigante poliploide de resistencia a los fármacos células cancerosas utilizando la línea celular epitelial PC313. Si bien presentamos la aplicación de esta plataforma para entender la dinámica espaciotemporal de las células epiteliales de cáncer de próstata PC3 y mesenquimales bajo un gradiente de estrés de docetaxel, el sistema microfluídico se puede aplicar fácilmente a cualquier combinación de líneas celulares y gradientes de recursos (es decir, drogas, nutrientes, oxígeno).
Protocol
Representative Results
Discussion
El cultivo celular convencional se desarrolló hace casi un siglo y sigue siendo el modelo preclínico más utilizado en la investigación biomédica, a pesar de su probada capacidad limitada para predecir los resultados clínicos en el cáncer17. Los modelos animales ofrecen la mayor relevancia fisiológica y una similitud genética razonable con los seres humanos, pero durante mucho tiempo se ha reconocido que tienen limitaciones significativas en la predicción de los resultados humanos<sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
Riferimenti
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