Generering av heterogena Läkemedelgradienter över cancer populationer på en Microfluidic evolution Accelerator för real tids observation
Summary
Vi presenterar en mikroflödessystem cancer-on-chip modell, “evolution Accelerator”-teknik, som ger en kontrollerbar plattform för långsiktiga realtid kvantitativa studier av cancerdynamik inom väl definierade miljöförhållanden på Single-cell Nivå. Denna teknik förväntas fungera som en in vitro-modell för grundforskning eller preklinisk läkemedelsutveckling.
Abstract
Konventionell cellkultur är fortfarande den vanligast förekommande prekliniska modellen, trots dess bevisade begränsade förmåga att förutsäga kliniska resultat i cancer. Microfluidic cancer-on-chip modeller har föreslagits för att överbrygga klyftan mellan förenklad konventionella 2D kulturer och mer komplicerade djurmodeller, som har begränsad förmåga att producera pålitliga och reproducerbara kvantitativa resultat. Här presenterar vi en mikroflödessystem cancer-on-chip modell som återger viktiga komponenter i en komplex tumör mikromiljö på ett omfattande sätt, men är enkel nog att ge robusta kvantitativa beskrivningar av cancerdynamik. Denna mikroflödessystem cancer-on-chip modell, “evolution Accelerator,” bryter ner en stor population av cancerceller i en sammanlänkad matris av tumör mikromiljöer samtidigt skapa en heterogen kemoterapeutiska stress landskap. Progressionen och den evolutionära dynamiken av cancer som svar på drogen gradient kan övervakas i veckor i realtid, och många nedströms experiment kan utföras kompletterar de tidsförlopp bilder tagna genom loppet av experimenten.
Introduction
Cancer har blivit alltmer erkänd som ett komplext ekosystem som beror inte bara på fortsatt dysreglering av muterade cellpopulationer utan också på vitala interaktioner mellan cancerceller och värd mikromiljö. I denna mening, cancer utvecklas på ett adaptivt landskap manifesteras genom en kombination av faktorer, inklusive en heterogen tumör mikromiljö och överhörning med en mängd olika värdceller, som alla bidrar selektivt tryck för ytterligare genetiska eller epigenetiska förändringar1,2,3. I samband med solida tumörer, ojämn fördelning av kemoterapeutika och andra resursgradienter bidrar till deras molekylära heterogenitet och kan spela en roll i utvecklingen av läkemedelsresistens, ökad angiogenes till viss tumör subpopulationer, och även metastaser4,5,6. Konventionella in vitro 2D-cellkulturstudier, samtidigt som den besitter storskalig, praktisk experimentell kapacitet, ger ett medelvärde-fält, enhetliga och fasta förhållanden, som ofta saknar den exakta rumsliga och temporala Miljökontrollen som krävs för att verkligen emulera in vivo tumördynamik. Sålunda, det finns ett behov av mer representativa ex vivo modeller för att reproducera tumören mikromiljö före djurmodeller i drogen utveckling pipeline för att en bättre förutsägelse av cancer progression samt svar på läkemedel inom dynamisk stress Landskap. Mikrofluidik har föreslagits för att överbrygga klyftan mellan 2D-cellkulturstudier och mer komplexa in vivo djurstudier som kanske inte kan stödja kontrollerbara kvantitativa studier7,8,9.
Ett idealiskt in vitro-system för att karakterisera cancercelldynamik bör ha förmågan att generera en heterogen mikromiljö för att efterlikna de adaptiva cellulära svar som kan ske i en tumör, samt möjliggöra observation av dessa dynamik på en encells-upplösning. I denna artikel, vi beskriver en mikroflödessystem cellkultur plattform, en PDMS-baserad enhet som kallas “evolution Accelerator” (EA), som möjliggör parallella in vitro-studier av cancer celldynamik på cellulära upplösning med realtid datainsamling över loppet av veckor, medan stabilt upprätthålla gradienter av stress över kulturlandskapet. Utformningen av denna plattform är baserad på vårt tidigare arbete, där den evolutionära dynamiken i organismer i en metapopulation kan påskyndas10,11. Specifikt, i en grupp av rumsligt åtskilda populationer som samverkar på någon nivå, när de utsätts för en heterogen stress landskap, de mest lämpade arter kan dominera i en lokalbefolkning snabbare jämfört med en stor enhetlig befolkning. De fördelaktiga arterna migrerar sedan till angränsande mikrohabitat i sökandet efter resurser och utrymme, och så småningom dominerar hela befolkningen. Som framgår i figur 1, är mönstret av mikroflödessystem EA chip består av (i) ett par Serpentine kanaler som ger färsk Media cirkulation och konstruera fasta gräns förhållanden för kemisk diffusion, och (II) den hexagonala cellkultur regionen som består 109 sammankopplade hexagonala och 24 halv-hexagonala kammare i centrum, som liknar en Honeycomb struktur. Chippet är 100 μm på djupet. Mediekanaler och cellkultur regionen förbinds med små slitsar (ca 15 μm bred), vilket förhindrar direkt media flöde och den resulterande skjuvning stress över cellkultur området, men ändå tillåta kemikalier att sprida sig genom små slitsar och utbyta näringsämnen, metaboliskt avfall etc. Generering av kemiska gradienter visas i figur 1B, där en mediekanal innehåller 0,1 mm fluorescein medan den andra kanalen är fri från fluorescein. Celler odlas på ett gas genomsläppligt membran, inkapslat av mikrostrukturer genom det positiva mottrycket på membranet mot chippet. Komponenterna i enhetshållaren illustreras i figur 2, och den experimentella inställningen illustreras i figur 3, där kulturen upprätthålls på ett inverterat Mikroskop vid 37 ° c, med över 85% relativ fuktighet och konditioneras under normoxia gassammansättning.
Detta system ger detaljerad observation av lokaliserade cellulära interaktioner via brightfield och fluorescerande kanaler och möjliggör rumsligt-lösta nedströms analyser såsom immunofluorescens, Western blot, eller masspektrometri. Vi har tidigare visat som ett proof-of-princip av denna mikroflödessystem cancer-on-chip modell på långsiktig Co-kultur epitelial och mesenkymala PC3 prostatacancerceller12 samt uppkomsten av läkemedelsresistens polyploida jätte cancerceller med hjälp av epitelial PC3 cell linje13. Medan vi presenterar tillämpningen av denna plattform för att förstå den spatiotemporal dynamiken i epitelial PC3 och mesenkymala prostatacancerceller under en stressgradient av docetaxel, den mikroflödessystem systemet kan enkelt appliceras på någon kombination av cellinjer och resurs (dvs., läkemedel, näringsämnen, syre) gradienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konventionell cellkultur utvecklades för nästan ett sekel sedan och är fortfarande den mest använda prekliniska modellen inom biomedicinsk forskning, trots dess bevisade begränsade förmåga att förutsäga kliniska resultat i cancer17. Djurmodeller erbjuder den högsta fysiologiska relevansen och rimlig genetisk likhet med människor, men har länge erkänts ha betydande begränsningar för att förutsäga mänskliga utfall18. Bland alla befintliga prekliniska modelle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
