Qui, presentiamo un protocollo per la raccolta di spettri Raman confocali da soggetti umani in studi clinici combinati con approcci chemiometrici per la rimozione degli outlier spettrali e la successiva estrazione di caratteristiche chiave.
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Articolo metodologico
Risolvere acqua, proteine e lipidi da In Vivo Confocal Raman Spectra di Stratum Corneum attraverso un approccio chemiometrico
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo di questo metodo spettroscopico Raman confocale in vivo consente la misurazione diretta di acqua, proteine e lipidi con risoluzione di profondità nei soggetti umani. Queste informazioni sono molto importanti per le malattie legate alla pelle e caratterizzano le prestazioni dei prodotti per la cura della pelle. Questo protocollo illustra un metodo per la raccolta di spettri confocali Raman e la successiva analisi del set di dati spettrale sfruttando la chemiometria. L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire un protocollo standard per la raccolta dei dati e fornire indicazioni generali per l'analisi dei dati. La pre-elaborazione (ad esempio, la rimozione degli spettri anomali) è una fase critica nell'elaborazione di set di dati di grandi dimensioni da studi clinici. Ad esempio, forniamo indicazioni basate sulla conoscenza preliminare di un set di dati per identificare i tipi di outlier e sviluppare strategie specifiche per rimuoverli. Viene eseguita un'analisi dei componenti principali e gli spettri di carico vengono confrontati con gli spettri dei materiali di riferimento per selezionare il numero di componenti utilizzati nell'analisi finale della risoluzione della curva multivariata (MCR). Questo approccio ha esito positivo per l'estrazione di informazioni significative da un set di dati spettrale di grandi dimensioni.
Introduzione
Negli studi clinici, la spettroscopia Raman confocale in vivo ha dimostrato la sua capacità unica di determinare lo spessore dello strato di corneo e il contenuto d'acqua1,2,3,4e di tracciare la penetrazione materiali attivi applicati topicamente alla pelle5,6. Come approccio non invasivo, la spettroscopia confocale Raman rileva i segnali molecolari in base alle modalità vibrazionali. Pertanto, l'etichettatura non è necessaria7. La spettroscopia Raman confocale in vivo fornisce informazioni chimiche con risoluzione di profondità basata sulla natura confocale della tecnica. Queste informazioni dipendenti dalla profondità sono molto utili per studiare gli effetti dei prodotti per la cura della pelle4,8, invecchiamento9,10, cambiamenti stagionali3, così come le malattie di funzione di barriera cutanea, come la dermatite atopica11,12. Ci sono molte informazioni nella regione ad alta frequenza della spettroscopia confocale Raman (2.500–4.000 cm-1), dove l'acqua produce picchi distinti nella regione tra 3.250–3.550 cm-1. Tuttavia, i picchi Raman di proteine e lipidi, che sono centrati tra circa 2.800-3.000 cm-1, si sovrappongono a vicenda perché i segnali sono prodotti principalmente da gruppi di metilene (-CH2-) e metili (-CH3)13 . Queste informazioni sovrapposte presentano una sfida tecnica quando si ottengono quantità relative di singole specie molecolari. Per risolvere questa sfida sono stati utilizzati il montaggio di picco14,15 e la posizione di picco selettiva12,16 approcci. Tuttavia, è difficile per questi singoli metodi basati sul picco estrarre le informazioni pure sui componenti perché più picchi Raman dallo stesso componente cambiano contemporaneamente17. Nella nostra recente pubblicazione18è stato proposto un approccio MCR per chiarire le informazioni pure sui componenti. Utilizzando questo approccio, tre componenti (acqua, proteine e lipidi) sono stati estratti da un grande set di dati spettroscopici Raman confocale in vivo.
L'esecuzione di grandi studi clinici può essere impegnativa per gli individui che raccolgono dati spettroscopici in vivo. In alcuni casi, l'acquisizione spettrale può richiedere attrezzature operative per molte ore in un giorno e lo studio può estendersi fino a settimane o mesi. In queste condizioni, i dati spettroscopici possono essere generati da operatori di apparecchiature che non dispongono delle competenze tecniche necessarie per identificare, escludere e correggere tutte le fonti di artefatti spettroscopici. Il set di dati risultante può contenere una piccola frazione di outlier spettroscopici che devono essere identificati ed esclusi dai dati prima dell'analisi. Questo documento illustra in dettaglio un processo di analisi chemiometrica per "ripulire" un set di dati Clinico Raman prima di analizzare i dati con MCR. Per rimuovere correttamente gli outlier, è necessario identificare i tipi di outlier e la causa potenziale per la generazione degli spettri outlier. Quindi, è possibile sviluppare un approccio specifico per rimuovere gli outlier mirati. Ciò richiede una conoscenza preliminare del set di dati, inclusa una comprensione dettagliata del processo di generazione dei dati e della progettazione dello studio. In questo set di dati, la maggior parte degli outlier sono spettri bassi segnale-rumore e provengono principalmente da 1) spettri raccolti sopra la superficie della pelle (6.208 su 30.862) e 2) forte contributo allo spettro dalla luce della stanza fluorescente (67 su 30.862). Gli spettri raccolti sopra la superficie della pelle producono una risposta Raman debole, poiché il punto focale laser si avvicina alla superficie della pelle ed è per lo più nella finestra dello strumento sotto la pelle. Gli spettri con un forte contributo dalla luce fluorescente della stanza vengono generati a causa dell'errore dell'operatore dello strumento o del movimento del soggetto, il che produce una condizione in cui la finestra di raccolta confocale Raman non è completamente coperta dal sito del corpo del soggetto. Sebbene questi tipi di artefatti spettrali possano essere identificati e corretti durante l'acquisizione spettrale da parte di un esperto spettroscopico al momento dell'acquisizione dei dati, gli operatori di strumenti addestrati utilizzati in questo studio sono stati istruiti a raccogliere tutti i dati, a meno che è stato osservato un guasto catastrofico. Il compito di identificare ed escludere gli outlier è incorporato nel protocollo di analisi dei dati. Il protocollo presentato è stato sviluppato per risolvere questa sfida. Per affrontare gli spettri basso segnale-rumore sopra la superficie della pelle, la posizione della superficie della pelle deve essere determinata prima per consentire la rimozione degli spettri raccolti sopra la superficie della pelle. La posizione della superficie della pelle è definita come la profondità in cui il punto focale laser Raman è la metà della pelle e la metà fuori della pelle, come illustrato nella figura supplementare 1. Dopo aver rimosso gli spettri bassi segnale-rumore, viene implementata un'analisi principale dei componenti (PCA) per estrarre il fattore dominato dai picchi di luce ambiente fluorescenti. Questi outlier vengono rimossi in base al valore del punteggio del fattore corrispondente.
Questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come vengono determinati sei componenti principali nel processo MCR. Questo viene fatto attraverso un'analisi PCA seguita da confronto forma spettrale tra i carichi per i modelli generati con un diverso numero di componenti principali. Il processo sperimentale per la raccolta dei dati dei materiali di riferimento e dei soggetti umani è anche spiegato in dettaglio.
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale dell'Ospedale pediatrico di Pechino in conformità con le linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975. È stato condotto secondo le linee guida ICH per la buona pratica clinica. Lo studio ha avuto luogo da maggio a luglio 2015.
1. Collezione di spettri Raman confocali in vivo da soggetti umani con dermatite atopica
- Includere argomenti conformi ai seguenti criteri.
- Includere soggetti di età compresa tra 4 e 18 anni.
- Includere soggetti con dermatite atopica da lieve a moderata (punteggio di 2 o 3 secondo la valutazione globale del medico) con sintomi di malattia attivi sul 5%-30% della superficie corporea, con almeno due lesioni sulle braccia.
- Includere soggetti in buona salute, escludendo i sintomi direttamente correlati alla malattia di AD.
- Includere soggetti che forniscono il consenso informato scritto.
- Includere i soggetti con un valore ITA (Individual Topology Angle) superiore a 40 nella posizione di test.
- Escludere i soggetti che soddisfano uno dei seguenti criteri.
- Escludere i soggetti che stanno partecipando o che hanno precedentemente partecipato a uno studio clinico in qualsiasi struttura di prova nelle precedenti 4 settimane.
- Escludere soggetti con cancro o che sono stati diagnosticati o trattati per il cancro entro 5 anni prima dello studio.
- Escludere i soggetti diabetici.
- Escludere i soggetti affetti da una malattia immunologica o infettiva che potrebbe mettere il soggetto a rischio o interferire con l'accuratezza dei risultati dello studio (ad esempio, epatite, tubercolosi, HIV, AIDS, lupus o artrite reumatoide).
- Escludere i soggetti che hanno condizioni della pelle che potrebbero interferire con misurazioni strumentali o impediranno la chiara valutazione della pelle solo alla dermatite atopica. Esempi includono pelle estremamente secca, pelle danneggiata, tagli, graffi, scottature, segni di nascita, tatuaggi, cicatrici estese, eruzioni cutanee, crescita eccessiva dei capelli, o acne.
- Escludere i soggetti che utilizzano farmaci immunosoppressori orali, antibiotici o altre terapie sistemiche nell'ultimo mese, ad eccezione dei tranquillanti minori.
- Escludere i soggetti con qualsiasi altra condizione medica che, a parere dello sperimentatore, li impedisca di partecipare allo studio.
- Escludere i soggetti con una maggiore pigmentazione nell'area di prova.
- Etichettare l'area di lesione del partecipante allo studio della dermatite atopica e contrassegnare con un'area di 3 cm x 4 cm sul sito di lesione o vicino al sito di lesione, come illustrato nella Figura 1A.
- Etichettare l'area di non lesione con lo stesso indicatore nel sito del corpo della controparte (ad esempio, l'avambraccio sinistro contro l'avambraccio destro) come illustrato nella Figura 1B.
- Posizionare il sito del corpo contrassegnato a stretto contatto con la finestra dello strumento in vivo confocal Raman, come illustrato nella Figura 2A e Nella Figura 2B. Coprire l'intera finestra per evitare l'impatto della luce della stanza sul sito del corpo.
- Eseguire la raccolta dei dati Raman.
NOTA: Lo strumento ha una risoluzione spettrale di 2 cm-1 e 50x microscopia obiettivo (NA - 0,9 immersione olio), utilizzando un laser da 671 nm con una potenza di 17 mW. La lunghezza d'onda viene calibrata utilizzando lo spettro di una lampada al neon-argon integrata. La calibrazione dell'intensità viene eseguita misurando lo spettro di uno standard di calibrazione del vetro DEL NIST (National Institute of Standards).- Spostare lo stato attivo fino a quando non viene osservato uno spettro come illustrato nella Figura 2C, quindi spostare la messa a fuoco lontano dalla superficie della pelle di 10 m.
- Iniziare la raccolta dei dati per 26 fasi con una dimensione di passo di 2 m nella regione di frequenza 2.510 cm-1–4.000 cm-1. Utilizzare un tempo di esposizione di 1 s e misurare otto repliche per ogni area della durata totale di 10-15 min.
2. Raccolta di spettri confocali Raman da materiali di riferimento
- Collocare i materiali di riferimento, i principali componenti dello strato della pelle umana, il corneo19,sulla finestra dello strumento confocale Raman (vedi Tabella dei materiali: Bovine Serum Albumin (BSA), acqua divinonizzata (acqua DI), ceramide, colesterolo, acidi grassi e squalene).
- Raccogliere gli spettri Raman dei materiali di riferimento consecutivamente dall'esterno del materiale al centro del materiale utilizzando gli stessi parametri di raccolta descritti in precedenza.
- Integrare l'area sotto ogni spettrale Raman tra l'intervallo di 2.510-4.000 cm-1 e identificare i primi tre punti valore massimo in queste 26 misurazioni. Media degli spettri Raman da questi tre punti per ottenere gli spettri finali del materiale di riferimento.
3. Rimozione degli spettri outlier attraverso l'analisi chemiometrica
- Determinare la superficie della pelle e rimuovere gli spettri fuori pelle.
- Modificare l'estensione del file da '.ric' a '.mat' e caricare il file .mat sulla piattaforma software MATLAB.
- Correggere la linea di base utilizzando Linea di base (quadrati minimi ponderati automaticamente) facendo clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati importato in Analizza . Altri strumenti Pre-elaborazione nel software PLS_Toolbox con impostazione predefinita.
- Sommare i valori compresi tra 2.910–2.965 cm-1 per ottenere i valori di intensità in ogni spettro Raman dalla misurazione di 26 passi consecutivi, come illustrato nella Figura 3A tramite la funzione sum in MATLAB.
- Interpolare il valore di offset dello strumento (valore nell'asse X nella figura 3B) da 26 a 260 utilizzando la funzione linspace in MATLAB.
- Interpolare il valore di intensità da 26 a 260 utilizzando il metodo spline in MATLAB, sfruttando i valori di posizione 260 appena generati.
- Utilizzare le funzioni polifit e polivale di MATLAB per ottenere il nuovo insieme di valori di intensità con 260 punti. In primo luogo, utilizzare i valori di posizione e intensità 260 come input X e Y per la funzione polifit, rispettivamente. Impostare il valore del grado su 20. Quindi, utilizzare i coefficienti di output e i 260 valori di posizione estesa come input per il polivale per ottenere i valori di intensità 260 finali.
- Utilizzare le funzioni max e min di MATLAB per identificare i punti massimi e minimi dai valori di intensità 260 appena interpolati.
- Calcolare il valore dell'intensità media dividendo la somma del valore di intensità massima e minima per due.
- Identificare il valore di intensità dai valori di intensità 260 (calcolati dal punto 3.1.6) più vicino al valore di intensità media e impostare il valore della posizione corrispondente come superficie della pelle. Impostare questo valore di posizione come punto zero nell'asse X come illustrato nella Figura 3B.
- Modificare tutti gli altri valori di posizione in base al punto zero e alla dimensione nota del passo di 2 m.
- Rimuovere tutti gli spettri raccolti sopra la superficie della pelle in base al loro valore di posizione.
- Importare il resto dei dati in PLS_Toolbox per creare un set di dati e rinominarlo "RamanData.mat".
- Rimuovere gli spettri outlier con l'effetto di luce della stanza.
- Caricare il set di dati degli spettri Raman (RamanData.mat) dopo la rimozione degli spettri fuori interfaccia e implementare l'analisi PCA.
- Caricare il set di dati nel software PLS_Toolbox nella piattaforma MATLAB e fare clic con il pulsante destro del mouse sul dataset per scegliere Analizza . PCA.
- Selezionare Normalizza come approccio di pre-elaborazione e scegliere Nessuno per la convalida incrociata.
- Utilizzare i tre componenti per l'analisi di scomposizione PCA, come illustrato nella figura 2 supplementare.
- Rimuovere il coperchio nella finestra di raccolta dello strumento Raman in vivo e raccogliere gli spettri della luce ambiente nella regione ad alta frequenza utilizzando gli stessi parametri utilizzati per la raccolta dei dati dei materiali di riferimento.
- Identificare il fattore di effetto della luce della stanza attraverso il confronto con gli spettri di sfondo della luce della stanza, come mostrato nella Figura 3 supplementare.
- Rimuovere gli spettri con un valore di punteggio corrispondente significativamente più alto del normale (più del 99,8% dei valori di punteggio dell'intero set di dati, ovvero 0,16 in questo studio).
4. Selezione del numero dei componenti nell'analisi della decomposizione MCR
- Correggere la linea di base degli spettri Raman utilizzando lo stesso approccio descritto in precedenza (sezione 3.1.2).
- Eseguire l'analisi PCA sul set di dati pre-elaborato come descritto in precedenza (sezione 3.2) ad eccezione della selezione di "PQN" – "Mean Center" anziché "Normalize" e tracciare i valori eigenvalues in scala logaritmica insieme al numero di componenti (20) come numero predefinito in l'analisi di scomposizione facendo clic sul pulsante Scegli componenti e selezionare log(eigenvalues) come valore Y. Scegliere da tre a otto come numero di componenti utilizzati per l'analisi MCR.
- Eseguire l'analisi MCR.
- Caricare il set di dati nel software MCR_main20 tramite il pulsante Selezione dati.
- Scegliere il numero di componenti (da tre a otto) facendo clic sul pulsante Determinazione del numero di componenti.
- Fare clic sul pulsante Pure nella scheda Stima iniziale, selezionare Concentrazione nella scheda Direzione selezione variabile e fare clic sul pulsante Fai.
- Fare clic sul pulsante OK e quindi sul pulsante Continua alla pagina successiva.
- Fare clic su Continua nella pagina successiva, quindi selezionare fnnls e 6 rispettivamente nelle schede Implementazione e Nr. delle specie con profili non negatività. Fare clic sul pulsante Continua.
- Scegliere gli stessi parametri della sezione 4.3.5 per questa pagina e fare clic su Continua.
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Risultati
In questo studio clinico, sono stati raccolti spettri Raman confocali in vivo da 28 soggetti dai 4 ai 18 anni. Un totale di 30.862 spettri Raman sono stati raccolti con il protocollo di raccolta dati di cui sopra. Questo set di dati spettrale di grandi dimensioni contiene outlier spettrali del 20%, come illustrato nella figura 4A. Gli spettri outlier basso segnale-rumore sono stati rimossi dopo aver determinato la superficie della pelle, seguito dalla PCA per identificare gli spettri con...
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Discussione
Durante la raccolta dei dati, come descritto nei paragrafi 2 e 3 del protocollo, ogni profilo di profondità è stato raccolto in un'area con contatto tra la finestra dello strumento e la pelle trovando le aree più scure dalle immagini microscopiche evidenziate nei cerchi rossi in Figura 2C. Una volta individuate queste aree, è stato fondamentale iniziare il profilo di profondità sopra la superficie della pelle per determinare con precisione la posizione della superficie dell...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono molto il sostegno finanziario del dipartimento di assistenza alla pulizia della pulizia aziendale. Vogliamo esprimere la nostra gratitudine ai direttori associati analitici Ms. Jasmine Wang e Dr. Robb Gardner per la loro guida e supporto e la signora Li Yang per il suo aiuto sulla raccolta dei dati.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina sierica bovina Colesterolo | Sigma-Aldrich | ||
| Colesterolo | Sigma-Aldrich | ||
| 3-solfato di sodio | Sigma-Aldrich | ||
| D-Eritro-Diidrosfingosina | Sigma-Aldrich | ||
| DI acqua | Purificata con Milipore (18.2MΩ) | ||
| Analizzatore cutaneo Gen2-SCA | River Diagnostics, Rotterdam, Paesi Bassi | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-eritro-sfingosina | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroil-D-eritro-sfinganina(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Acido oleico | Sigma-Aldrich | ||
| Acido palmitico | Sigma-Aldrich | ||
| Acido palmitoleico | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox versione 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, Paesi Bassi | versione 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Acido stearico | Sigma-Aldrich |
Riferimenti
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