Løse vann, proteiner og lipider fra in vivo Konfokalmikroskopi Raman Spectra av stratum corneum gjennom en Chemometric Approach

Summary

Her presenterer vi en protokoll for innsamling av konfokalmikroskopi Raman Spectra fra menneskelige i kliniske studier kombinert med chemometric tilnærminger for Spectral avvikende fjerning og den påfølgende ekstraksjon av viktige funksjoner.

Abstract

Utvikling av denne in vivo konfokalmikroskopi Raman spektroskopiske metoden muliggjør direkte måling av vann, proteiner og lipider med dybde oppløsning i menneskelige. Denne informasjonen er svært viktig for hud-relaterte sykdommer og karakteriserer hudpleieprodukt ytelse. Denne protokollen illustrerer en metode for konfokalmikroskopi Raman Spectra samling og den påfølgende analyse av Spectral datasettet utnytte kjemometri. Målet med denne metoden er å etablere en standard protokoll for datainnsamling og gi generell veiledning for dataanalyse. Forbehandling (for eksempel fjerning av avvikende Spectra) er et kritisk trinn ved behandling av store datasett fra kliniske studier. Som et eksempel gir vi veiledning basert på tidligere kjennskap til et datasett for å identifisere outliers og utvikle spesifikke strategier for å fjerne dem. En hovedkomponent analyse utføres, og lasting Spectra sammenlignes med Spectra fra referansemateriale for å velge antall komponenter som brukes i den endelige multivariabel kurve oppløsning (MCR) analyse. Denne tilnærmingen er vellykket for å utvinne meningsfull informasjon fra en stor Spectral datasett.

Introduction

I kliniske studier har in vivo konfokalmikroskopi Raman spektroskopi vist sin unike evne til å bestemme stratum corneum tykkelse og vanninnhold^1,2,3,4, og sporing av inntrengning av aktivt materiale lokalt påføres huden^5,6. Som en ikke-invasiv tilnærming, konfokalmikroskopi Raman spektroskopi oppdager molekylære signaler basert på vibrasjonen moduser. Dermed er merking ikke nødvendig⁷. In vivo konfokalmikroskopi Raman spektroskopi gir kjemisk informasjon med dybde oppløsning basert på den konfokalmikroskopi natur teknikken. Denne dybde avhengige informasjonen er svært nyttig i å studere virkningene av hudpleieprodukter^4,8, aldring^9,10, sesongmessige endringer³, samt hudbarriere funksjon sykdommer, som atopisk dermatitt^11,12. Det er mye informasjon i høy frekvens regionen konfokalmikroskopi Raman spektroskopi (2500-4000 cm^-1), der vann produserer distinkte topper i regionen mellom 3250-3550 cm^-1. Men Raman toppene av proteiner og lipider, som er sentrert mellom ca 2800-3000 cm^-1, overlapper hverandre fordi signalene er hovedsakelig produsert fra metylen (-CH₂-) og methyl (-CH₃) grupper¹³ . Dette overlappet informasjon presenterer en teknisk utfordring ved innhenting relative mengder av individuelle molekylære arter. Toppmontering^14,15 og selektiv topp posisjon^12,16 tilnærminger har blitt brukt til å løse denne utfordringen. Det er imidlertid vanskelig for disse enkelt topp-baserte metoder for å trekke ut ren komponentinformasjon fordi flere Raman topper fra samme komponent endres samtidig¹⁷. I vår nylige utgivelse¹⁸ble en MCR-tilnærming foreslått for å belyse den rene komponentinformasjonen. Ved hjelp av denne tilnærmingen, tre komponenter (vann, proteiner og lipider) ble utvunnet fra en stor in vivo konfokalmikroskopi Raman spektroskopiske datasett.

Gjennomføringen av store kliniske studier kan være krevende for enkeltpersoner å samle inn vivo spektroskopiske data. I noen tilfeller kan Spectral oppkjøp kreve drifts utstyr i mange timer på en dag, og studien kan forlenge opp til uker eller måneder. Under disse forholdene kan spektroskopiske data genereres av utstyrs operatører som mangler teknisk ekspertise for å identifisere, ekskludere og korrigere for alle kilder til spektroskopiske artefakter. Det resulterende datasettet kan inneholde en liten brøkdel av spektroskopiske outliers som må identifiseres og ekskluderes fra dataene før analysen. Dette papiret illustrerer i detalj en chemometric analyse prosess for å “rydde opp” et klinisk Raman datasett før analysere dataene med MCR. Å med hell fjerne det outliers, typene av outliers og det muligheter anledning for det generasjon av det avvikende Spectra nød å bli kjennemerke. Deretter kan en bestemt tilnærming utvikles for å fjerne målrettede outliers. Dette krever forhåndskunnskap om datasettet, inkludert en detaljert forståelse av dataene og studie utformingen. I dette datasettet, flertallet av outliers er lav signal-til-støy Spectra og kommer først og fremst fra 1) Spectra samlet over hudoverflaten (6 208 av 30 862), og 2) sterkt bidrag til spekteret fra fluorescerende rom lys (67 ut av 30 862). Spectra samlet over hudoverflaten produsere en svak Raman respons, som laser fokuspunktet nærmer seg hudoverflaten og er for det meste i instrumentet vinduet under huden. Spectra med et sterkt bidrag fra fluorescerende rom lys genereres på grunn av enten instrument operatørfeil eller motivbevegelse, som produserer en tilstand der konfokalmikroskopi Raman samling vinduet ikke er fullt ut dekket av faget kropp nettsted. Selv om disse typene av Spectral artefakter kunne identifiseres og utbedres i løpet av Spectral oppkjøp av en spektroskopiske-ekspert på tidspunktet for datainnhenting, ble de trente instrument operatørene som ble brukt i denne studien, instruert til å samle inn alle data med katastrofal svikt ble observert. Oppgaven med å identifisere og ekskludere outliers er innlemmet i dataanalyse protokollen. Protokollen som presenteres er utviklet for å løse denne utfordringen. For å møte den lave signal-til-støy Spectra over hudens overflate, må plasseringen av hudoverflaten bestemmes først for å tillate fjerning av Spectra samlet over hudoverflaten. Plasseringen av hudoverflaten er definert som dybden der Raman laser knutepunkt er halvparten i huden og halvparten ut av huden som illustrert i supplerende figur 1. Etter å ha fjernet lav signal-til-støy Spectra, en rektor komponent analyse (PCA) er implementert for å trekke ut faktoren dominert av fluorescerende rom lys topper. Disse outliers er fjernet basert på score verdien av den tilsvarende faktoren.

Denne protokollen gir detaljert informasjon om hvordan seks hovedkomponenter bestemmes i MCR-prosessen. Dette gjøres gjennom en PCA-analyse etterfulgt av Spectral figur sammenligning mellom belastninger for modeller generert med et ulikt antall hovedkomponenter. Den eksperimentelle prosessen for datainnsamling av referansematerialer så vel som de menneskelige fagene er også forklart i detalj.

Protocol

Denne studien ble godkjent av den institusjonelle gjennomgangen komité Beijing Children ‘ s Hospital i samsvar med de etiske retningslinjene i 1975 erklæringen av Helsingfors. Det ble gjennomført i henhold til ICH retningslinjer for god klinisk praksis. Studien fant sted fra mai til juli 2015. 1. innsamling av in vivo konfokalmikroskopi Raman Spectra fra menneskelige motiver med atopisk dermatitt Inkluder emner i samsvar med følgende kriterier. Ta med emner mellom 4 – 1…

Representative Results

I denne kliniske studien ble in vivo konfokalmikroskopi Raman Spectra samlet inn fra 28 fra 4 – 18 år gammel. Totalt 30 862 Raman Spectra ble samlet inn med datainnsamlings protokollen nevnt ovenfor. Denne store Spectral datasettet inneholder 20% Spectral outliers som vist i Figur 4A. Den lave signal-til-støy avvikende Spectra ble fjernet etter fastsettelse hudoverflaten, etterfulgt av PCA å identifisere Spectra med lysfunksjoner. Den tredje faktoren i denne PCA-modellen er identifi…

Discussion

I løpet av datainnsamlingen, som beskrevet i punkt 2 og 3 i protokollen, ble hver dybde profil samlet i et område med kontakt mellom instrument vinduet og huden ved å finne de mørkere områdene fra de mikroskopiske bildene som er uthevet i de røde sirklene i Figur 2C. Når disse områdene var plassert, var det avgjørende å starte dybde profilen over hudoverflaten for å nøyaktig bestemme plasseringen av hudens overflate for dataanalyse prosedyre. Plasseringen av hud…

Materials

Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich
Cholesterol	Sigma-Aldrich
Cholesterol 3-sulfate sodium	Sigma-Aldrich
D-Erythro-Dihydrosphingosine	Sigma-Aldrich
DI water			Purified with Milipore(18.2MΩ)
Gen2-SCA skin analyzer	River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands	Gen2
Matlab 2018b	Mathwork	2018b
N-behenoyl-D-erythro-sphingosine	Avanti Polar Lipids, Inc.
N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide)	Avanti Polar Lipids, Inc.
Oleic Acid	Sigma-Aldrich
Palmitic Acid	Sigma-Aldrich
Palmitoleic Acid	Sigma-Aldrich
PLS_Toolbox version 8.2	Eigenvector Research Inc.	8.2
RiverICon	River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands	version 3.2
Squalene	Sigma-Aldrich
Stearic Acid	Sigma-Aldrich