Разрешите воду, протеины, и Липиды от In Vivo Confocal Raman Spectra Stratum Corneum через хемометрический подход
Summary
Здесь мы представляем протокол для сбора конфокальных спектров Раман из человеческих субъектов в клинических исследованиях в сочетании с химиометрическими подходами для удаления спектральных выбросов и последующего извлечения ключевых особенностей.
Abstract
Разработка этого in vivo confocal Raman спектроскопического метода позволяет непосредственно измерять воду, белки и липиды с разрешением глубины у людей. Эта информация очень важна для заболеваний, связанных с кожей и характеризующих производительность продукта по уходу за кожей. Этот протокол иллюстрирует метод сбора конфокальных спектров Раман и последующего анализа спектрального набора данных с использованием химиометрии. Цель этого метода заключается в создании стандартного протокола для сбора данных и обеспечении общего руководства для анализа данных. Предварительная обработка (например, удаление спектров выбросов) является критическим шагом при обработке больших наборов данных из клинических исследований. В качестве примера мы предоставляем рекомендации, основанные на предварительных знаниях набора данных для определения типов выбросов и разработки конкретных стратегий для их устранения. Выполняется основной анализ компонентов, а спектры загрузки сравниваются со спектрами из справочных материалов для выбора количества компонентов, используемых в окончательном анализе разрешения многовариантной кривой (MCR). Этот подход успешен для извлечения значимой информации из большого спектрального набора данных.
Introduction
В клинических исследованиях, in vivo confocal Раман спектроскопии показал свою уникальную способность для определения толщины роговицы слоя и содержания воды1,2,3,4, и отслеживания проникновения активные материалы местно применяется к коже5,6. В качестве неинвазивного подхода конфокальная Рамана спектроскопия обнаруживает молекулярные сигналы на основе вибрационных режимов. Таким образом, маркировка не требуется7. In vivo confocal Raman спектроскопия обеспечивает химическую информацию с разрешением глубины на основе конфокального характера техники. Эта глубинно зависимая информация очень полезна при изучении последствий продуктов по уходу за кожей4,8,старение9,10, сезонные изменения3,а также заболевания функции кожного барьера, атопический дерматит11,12. Существует много информации в высокочастотной области конфокальной раманской спектроскопии (2500-4000 см-1),где вода производит различные пики в регионе между 3250-3,550 см-1. Тем не менее, Раман пики белков и липидов, которые сосредоточены между примерно 2800-3000 см-1, перекрывают друг друга, потому что сигналы в основном производятся из метилена (-CH2-) и метил (-CH3)группы 13 . Эта перекрытая информация представляет собой техническую проблему при получении относительного количества отдельных молекулярных видов. Для решения этой задачи были использованы пиковые установки14,15 и селективная пиковая позиция12,16 подходов. Тем не менее, это трудно для этих одного пиковых методов для извлечения чистой информации компонента, потому что несколько пиков Раман из одного и того же компонента изменения одновременно17. В нашей недавней публикации18, MCR подход был предложен, чтобы прояснить чисто компонент информации. Используя этот подход, три компонента (вода, белки и липиды) были извлечены из большого in vivo конфокального спектроскопического набора данных Раман.
Выполнение крупных клинических исследований может быть требовательным к лицам, собирающим в vivo спектроскопические данные. В некоторых случаях, спектральные приобретения может потребовать операционного оборудования в течение многих часов в день, и исследование может продлиться до недель или месяцев. В этих условиях спектроскопические данные могут генерироваться операторами оборудования, которые не имеют технических знаний для выявления, исключения и исправления всех источников спектроскопических артефактов. Полученный набор данных может содержать небольшую часть спектроскопических выбросов, которые необходимо идентифицировать и исключить из данных до анализа. В этой статье подробно иллюстрируется процесс химиометрического анализа для «очистки» клинического набора данных Рамына перед анализом данных с помощью MCR. Для успешного удаления выбросов необходимо определить типы выбросов и потенциальную причину генерации спектров выбросов. Затем может быть разработан конкретный подход для удаления целевых выбросов. Это требует предварительного знания набора данных, включая детальное понимание процесса генерации данных и проектирования исследования. В этом наборе данных большинство выбросов являются низкой спектрами сигнала к шуму и происходят в основном из 1) спектров, собранных над поверхностью кожи (6208 из 30 862), и 2) сильный вклад в спектр от флуоресцентного света комнаты (67 из 30 862). Спектры, собранные над поверхностью кожи, производят слабую реакцию Раман, так как лазерный координационный центр приближается к поверхности кожи и в основном находится в окне прибора под кожей. Спектра с сильным вкладом флуоресцентного света комнаты генерируются либо из-за ошибки оператора инструмента или субъекта движения, который производит условие, при котором конфоконсльное окно коллекции Раман не полностью покрыто тела объекта субъекта. Хотя эти типы спектральных артефактов могут быть идентифицированы и исправлены в ходе спектрального приобретения спектроскопическим экспертом во время получения данных, обученным операторам приборов, использоваваемым в этом исследовании, было поручено собирать все данные, если катастрофический сбой наблюдался. Задача выявления и исключения выбросов включена в протокол анализа данных. Представленный протокол разработан для решения этой проблемы. Для решения низких сигнальных-шумовых спектров над поверхностью кожи необходимо сначала определить местоположение поверхности кожи, чтобы позволить удаление спектров, собранных над поверхностью кожи. Расположение поверхности кожи определяется как глубина, где Раман лазерный координационный центр наполовину в коже и половина из кожи, как показано на дополнительной рисунке 1. После удаления низкой спектры сигнала к шуму, основной анализ компонентов (PCA) реализуется для извлечения фактора, в котором доминируют флуоресцентные пики света комнаты. Эти выбросы удаляются на основе значения оценки соответствующего фактора.
Этот протокол содержит подробную информацию о том, как шесть основных компонентов определяются в процессе MCR. Это делается на основе анализа PCA с последующим сравнением спектральной формы между нагрузками для моделей, генерируемых с разным количеством основных компонентов. Подробно подробно разъясняется также экспериментальный процесс сбора данных справочных материалов, а также и субъектов человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время сбора данных, как описано в разделе 2 и 3 протокола, каждый профиль глубины был собран в области со контактом между окном инструмента и кожей, найдя темные области из микроскопических изображений, выделенных в красных кругах в Рисунок 2C. После того, как э…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы в значительной степени признают финансовую поддержку со стороны отдела корпоративной функции аналитического и личного чистки. Мы хотим выразить нашу благодарность директорам по аналитическим партнерам г-же Джасмин Ван и д-ру Роббу Гарднеру за их руководство и поддержку, а г-же Ли Ян за помощь в сборе данных.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
Riferimenti
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth – scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. . Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients’ stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. . In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
