स्क्रीनिंग और एक Phage प्रदर्शन पेप्टाइड लाइब्रेरी का उपयोग कर Fibroblast विकास कारक Receptor2 को लक्षित छोटे पेप्टाइड की पहचान
Summary
यहाँ, हम छोटे पेप्टाइड्स है कि FGFR2 के लिए बाध्य एक phage प्रदर्शन पेप्टाइड पुस्तकालय का उपयोग स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम आगे इन विट्रो में FGFR2 और सेल प्रसार को दबाने की क्षमता की ओर चयनित पेप्टाइड्स की समानता का विश्लेषण.
Abstract
मानव फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (एफजीएफआर) परिवार में चार सदस्य शामिल हैं, नामत, FGFR1, FGFR2, FGFR3, और FGFR4, जो सेल प्रसार, अस्तित्व, प्रवास और भेदभाव सहित विभिन्न जैविक गतिविधियों में शामिल हैं। उत्परिवर्तन या जीन प्रवर्धन की घटनाओं के कारण, FGFR संकेतन मार्ग में कई विपथन, कैंसर के विभिन्न प्रकार में पहचान की गई है. इसलिए, हाल ही में अनुसंधान FGFRs के चिकित्सीय लक्ष्यीकरण शामिल रणनीतियों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है. पूर्व नैदानिक और नैदानिक विकास के विभिन्न चरणों में वर्तमान FGFR inhibitors या तो टायरोसिन kinases के छोटे अणु inhibitors शामिल हैं या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, पाइप लाइन में केवल कुछ पेप्टाइड-आधारित अवरोधकों के साथ। यहाँ, हम FGFR2 के विरोधी के रूप में छोटे पेप्टाइड्स स्क्रीन करने के लिए phage प्रदर्शन प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. संक्षेप में, phage-प्रदर्शित पेप्टाइड्स के एक पुस्तकालय FGFR2 के साथ लेपित एक थाली में incubated था. बाद में, असीम phage TBST द्वारा धोया गया था (टीबीएस + 0.1% [v/v] ट्वीन-20), और बाध्य phage 0.2 M glycine-HCl बफर (पीएच 2.2) के साथ eluted किया गया था. eluted phage आगे परिलक्षित किया गया था और biopanning के अगले दौर के लिए इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया. बायोपैनिंग के तीन दौर के बाद, व्यक्तिगत फेज क्लोन के पेप्टाइड दृश्यों की पहचान डीएनए अनुक्रमण द्वारा की गई थी। अंत में, स्क्रीन पेप्टाइड्स संश्लेषित और आत्मीयता और जैविक गतिविधि के लिए विश्लेषण किया गया.
Introduction
Fibroblast विकास कारक रिसेप्टर्स (FGFRs) सेल प्रसार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, घाव भरने, और विवो1में एंजियोजेनेसिस . FGFR संकेतन के Aberrant सक्रियण ट्यूमरकीएक किस्म में मनाया 2,3,4,5 जीन प्रवर्धन, जीन उत्परिवर्तन, गुणसूत्र विपथन, और अत्यधिक लिगंड स्राव6 शामिल हैं . FGFRs को लक्षित कई inhibitors नैदानिक परीक्षणों में होनहार चिकित्सीय प्रभाव दिखाया गया है और मुख्य रूप से तीन प्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं: (1) छोटे अणु kinase inhibitors, जो FGFR के intracellular डोमेन के लिए बाध्य, (2) विरोधी को लक्षित extracellular खंड, और (3) FGF ligand जाल6| यद्यपि अनेक छोटे अणु काइनेज अवरोधकों का विट्रो और विवो7दोनों में अच्छा चिकित्सीय प्रभाव होता है , फिर भी उनमें से अधिकांश का लक्ष्य विशिष्टता नहीं है और उच्च रक्तचाप8जैसे प्रतिकूल प्रभाव दिखाई देते हैं . अधिकांश विरोधी एक-एक एंटीबॉडी9,10 और पॉलीपेप्टाइड11हैं . पेप्टाइड्स उनकी विशिष्टता और कम साइड इफेक्ट के कारण छोटे अणुओं पर लाभ है. वे कोशिका पारगम्यता को भी बनाए रखते हैं और प्रोटीन औषधियोंकीतुलना में विशिष्ट अंगों में संचित नहीं होते . इसलिए, लक्षित छोटे पेप्टाइड्स दोनों प्रभावी और संभावित चिकित्सीय एजेंट हैं।
फाज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी छोटे पेप्टाइडों की पहचान करने के लिए एक आसान लेकिन शक्तिशाली उपकरण है जो किसी दिए गए अणु13,14,15को बाध्य कर सकता है . हमने एक फैज डिस्प्ले पेप्टाइड लाइब्रेरी का उपयोग किया जो एक साधारण M13 फैज पर आधारित है जिसमें 109 से अधिक विभिन्न पेप्टाइड अनुक्रम ों के साथ, जो लक्ष्य अणु के लिए बाध्य करने के लिए पूंछ पर प्रदर्शित होते हैं (सामग्री की तालिकादेखें )16. दिए गए अणु के प्रति phages की उच्च आत्मीयता के कारण, असीम phages धोया जा सकता है, और केवल कसकर बंधे phages वांछित कम पेप्टाइड्स के साथ बनाए रखा है. दिए गए आणविक लक्ष्यों को स्थिर प्रोटीन17,18, कार्बोहाइड्रेट , सुसंस्कृत कोशिकाओं , या यहां तक कि अकार्बनिक पदार्थ19,20से स्थिर किया जा सकता है . एक रोमांचक मामले की सूचना मिली जहां अंग-विशिष्ट पेप्टाइड्स का चयन विवो में फैज डिस्प्ले टेक्नोलॉजी21का उपयोग करके किया गया था। phage प्रदर्शन प्रौद्योगिकी के लाभ उच्च थ्रूपुट, आपरेशन में आसानी, कम लागत और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला22शामिल हैं.
इस अध्ययन में, हम स्क्रीनिंग छोटे पेप्टाइड्स immobilized प्रोटीन के लिए बाध्यकारी की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान (FGFR2) एक phage प्रदर्शन पुस्तकालय का उपयोग कर. प्रौद्योगिकी की प्रभावकारिता भी Isothermal Titration कैलोरीमेट्री द्वारा FGFR2 की ओर प्राप्त पेप्टाइड की समानता को मापने के द्वारा जांच की है (आईटीसी), और एक सेल प्रसार परख द्वारा जैविक गतिविधि. विधि छोटे पेप्टाइड्स कि कार्बोहाइड्रेट के लिए बाध्य स्क्रीनिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है, सुसंस्कृत कोशिकाओं, या यहां तक कि अकार्बनिक सामग्री.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक combinatorial phage पुस्तकालय उपन्यास पेप्टाइड्स है कि लक्ष्य अणुओं बाँध और उनके समारोह13को विनियमित कर सकते हैं की उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली और प्रभावी उपकरण है. वर्तमान में, phage प्रदर्शन…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ग्वांग्झू के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (सं. 2016201604030039) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
Riferimenti
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