ファージ表示ペプチドライブラリーを用いて線維芽細胞増殖因子受容体2を標的とする小ペプチドのスクリーニングと同定
Summary
本明細書では、ファージ表示ペプチドライブラリーを用いてFGFR2に結合する小さなペプチドをスクリーニングするための詳細なプロトコルを提示する。さらに、インビトロのFGFR2に対する選択されたペプチドの親和性と細胞増殖を抑制する能力を分析した。
Abstract
ヒト線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)ファミリーは、細胞増殖、生存、移行および分化を含む様々な生物学的活動に関与する4つのメンバー、すなわち、FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4からなる。変異または遺伝子増幅イベントに起因するFGFRシグナル伝達経路におけるいくつかの収差は、様々なタイプの癌で同定されている。したがって、最近の研究は、FGFRの治療的ターゲティングを含む戦略の開発に焦点を当てています.モノクローナル抗体は、パイプライン内のいくつかのペプチドベースの阻害剤しか持ち合わせていません。ここでは、FGFR2のアンタゴニストとして小さなペプチドをスクリーニングするファージ表示技術を用いるプロトコルを提供する。簡単に言えば、ファージ表示ペプチドのライブラリーをFGFR2でコーティングしたプレートでインキュベートした。続いて、非結合ファージをTBST(TBS+0.1%[v/v]Tween-20)によって洗い流し、結合ファージを0.2Mグリシン-HClバッファー(pH2.2)でelate化した。elutedファージをさらに増幅し、バイオパンニングの次のラウンドの入力として使用した。3回のバイオパンニングの後、個々のファージクローンのペプチド配列をDNAシーケンシングにより同定した。最後に、スクリーニングされたペプチドを合成し、親和性および生物学的活性について分析した。
Introduction
線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)は、生体内1における細胞増殖、創傷治癒、血管新生において重要な役割を果たす。様々な腫瘍2、3、4、5で観察されるFGFRシグナル伝達の異常な活性化は、遺伝子増幅、遺伝子変異、染色体収差、および過剰なリガンド分泌6を含む.FGFRを標的とする多くの阻害剤は、臨床試験において有望な治療効果を示しており、主に(1)FGFRの細胞内ドメインに結合する(1)低分子キナーゼ阻害剤、(2)アンタゴニストを標的とするアンタゴニスト細胞外セグメント、および (3) FGF リガンドトラップ6.いくつかの小分子キナーゼ阻害剤はインビトロとインビボ7の両方で良好な治療効果を有するが、それらのほとんどは標的特異性が悪く、高血圧8などの副作用を示す。アンタゴニストの大部分は、モノクローナル抗体9、10およびポリペプチド11である。ペプチドは、その特異性と低い副作用のために小分子よりも利点があります。.それらはまた細胞透過性を保持し、タンパク質薬12と比較して特定の器官に蓄積しない。したがって、標的化された小ペプチドは、有効かつ将来的な治療薬の両方である。
ファージ表示技術は、与えられた分子13、14、15に結合することができる小さなペプチドを識別するための簡単だが強力なツールである。標的分子に結合するために尾部に表示される10以上の9種類のペプチド配列を有する単純なM13ファージに基づくファージ表示ペプチドライブラリーを用いた(材料の表を参照)16。与えられた分子に対するファージの親和性が高いため、結合されていないファージを洗い流し、所望の短いペプチドと密接に結合したファージのみが保持されます。与えられた分子標的は、固定化タンパク質17、18、炭水化物、培養細胞、あるいは無機材料19、20であってもある。ファージ表示技術21を用いて生体内で臓器特異的ペプチドが選択されたエキサイティングな症例が報告された。ファージディスプレイ技術の利点は、高スループット、操作の容易さ、低コストとアプリケーションの広い範囲2を含みます。
本研究では、ファージ表示ライブラリーを用いて固定化タンパク質(FGFR2)に結合する小さなペプチドをスクリーニングする詳細なプロトコルを提供する。この技術の有効性は、イソソーマル滴定カロリー(ITC)によるFGFR2に対する得られたペプチドの親和性、および細胞増殖アッセイによる生物活性を測定することによっても検討される。この方法は、炭水化物、培養細胞、あるいは無機材料に結合する小さなペプチドをスクリーニングするために拡張されてもよい。
Protocol
Representative Results
Discussion
組み合わせファージライブラリーは、標的分子を結合し、その機能13を調節することができる新規ペプチドのハイスループットスクリーニングのための強力かつ効果的なツールです。現在、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、幅広い用途を持っている。例えば、それらは、受容体タンパク質23に結合した生理活性ペプチド23、非タンパク質<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は広州科学技術プログラム(No.201604030039)によって支援されました。
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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