在此,我们提出了使用噬菌体显示肽库筛选与 FGFR2 结合的小肽的详细方案。我们进一步分析了所选肽在体外对FGFR2的亲和力及其抑制细胞增殖的能力。
人类纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族由四个成员组成,即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4,它们参与各种生物活动,包括细胞增殖、存活、迁移和分化。由于突变或基因扩增事件,FGFR信号通路中的几个畸变在不同类型的癌症中被识别出来。因此,最近的研究侧重于开发涉及FGFRs治疗靶向的策略。 目前在临床前和临床开发的不同阶段,目前的FGFR抑制剂包括酪氨酸激酶的小分子抑制剂或单克隆抗体,管道中只有几种肽抑制剂。在这里,我们提供了一个协议,使用噬菌体显示技术来筛选小肽作为FGFR2的拮抗剂。简单地说,在涂有FGFR2的板中孵育出一个噬菌体显示肽库。随后,未结合的噬菌体被TBST(TBS = 0.1%[v/v]补间-20)洗掉,并结合噬菌体用0.2M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.2)洗净。洗脱的噬菌体被进一步放大,并用作下一轮生物泛化的输入。经过三轮生物盘分,通过DNA测序确定了单个噬菌体克隆的肽序列。最后,对筛选的肽进行合成,分析亲和力和生物活性。
纤维细胞生长因子受体(FGFRs)在细胞增殖、伤口愈合和体内血管生成中起着关键作用。在各种肿瘤2、3、4、5中观察到的FGFR信号异常激活包括基因扩增、基因突变、染色体畸变和过量配体分泌6.许多针对FGFRs的抑制剂在临床试验中显示出有希望的治疗效果,主要分为三类:(1)小分子激酶抑制剂,它与FGFR的细胞内域结合,(2)针对细胞外段和(3)FGF配体陷阱6。虽然几种小分子激酶抑制剂在体外和体内均具有良好的治疗效果,但大部分靶点特异性较差,并表现出高血压8等不良反应。大多数拮抗剂是单克隆抗体9、10和多肽11。肽具有比小分子的优势,由于其特异性和较低的副作用。与蛋白质药物12相比,它们还保留了细胞渗透性,不会在特定器官中积累。因此,靶向小肽是有效和前瞻性的治疗剂。
噬菌体显示技术是一个简单但强大的工具,用于识别小肽,它可以结合到给定的分子13,14,15。我们使用一个噬菌体显示肽库,它基于一个简单的M13噬菌体,在尾部显示超过109个不同的肽序列,以便与目标分子结合(见材料表)16。由于噬菌体对给定分子的亲和力高,未结合的噬菌体可以被冲走,并且只保留与所需短肽紧密结合的噬菌体。给定的分子靶点可以固定蛋白质17,18,碳水化合物,培养细胞,甚至无机材料19,20。一个令人兴奋的案例是,使用噬菌体显示技术21在体内选择器官特异性肽。噬菌体显示技术的优点包括高通量、易操作性、低成本和广泛的应用22。
在这项研究中,我们使用噬菌体显示库提供了筛选与固定蛋白(FGFR2)结合的小肽的详细方案。通过测量通过同质滴度测定仪(ITC)获得的肽对FGFR2的亲和力,以及通过细胞增殖测定的生物活性,也检查了该技术的疗效。该方法可以扩展用于筛选与碳水化合物、培养细胞甚至无机材料结合的小肽。
组合噬菌体库是一种强大而有效的工具,用于高通量筛选新型肽,这种肽可以结合目标分子并调节其功能13。目前,噬菌体显示肽库有着广泛的应用。例如,它们可用于选择与受体蛋白23结合的生物活性肽23、非蛋白靶点24、25、疾病特异性抗原模仿13、细胞特异性肽26、<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了广州市科技计划(第201620160403039号)的支持。
0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
-96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
96-well plate | Nest | 701001-2 | |
Agar | Beyotime | ST004D | |
Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
DMF | Newprobe | PB10247 | |
EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
IPTG | Beyotime | ST097 | |
ITC200 system | MicroCal Omega | ||
NaCl | Sigma | S6191 | |
NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
NaI | Bidepharm | BD40879 | |
NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
X-gal | Beyotime | ST912 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |