Heri præsenterer vi en detaljeret protokol til screening af små peptider, der binder sig til FGFR2 ved hjælp af et fagtypning-display peptid-bibliotek. Vi analyserer yderligere affiniteten af de valgte peptider mod FGFR2 in vitro og dets evne til at undertrykke celle proliferation.
Den humane fibroblast vækstfaktor receptor (FGFR) familie består af fire medlemmer, nemlig FGFR1, FGFR2, FGFR3 og FGFR4, der er involveret i forskellige biologiske aktiviteter, herunder celle spredning, overlevelse, migration og differentiering. Flere afvigelser i FGFR signalering pathway, på grund af mutationer eller genamplifikation hændelser, er blevet identificeret i forskellige typer af kræft. Nyere forskning har derfor fokuseret på at udvikle strategier, der involverer terapeutisk målretning af FGFRs. nuværende FGFR-hæmmere på forskellige stadier af præklinisk og klinisk udvikling omfatter enten små molekyle hæmmere af tyrosinkinaser eller monoklonalt antistoffer, med kun få peptidbaserede hæmmere i rørledningen. Her giver vi en protokol ved hjælp af fagtypning display teknologi til at screene små peptider som antagonister af FGFR2. Kort, et bibliotek af Phage-viste peptider blev inkuberet i en plade belagt med FGFR2. Efterfølgende blev ubundet fagtypning vasket af tbst (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), og bundet fagtypning blev elueret med 0,2 M Glycin-HCL buffer (pH 2,2). Den elueret fagtypning blev yderligere forstærket og anvendt som input til den næste runde af biopanning. Efter tre runder af biopanning blev peptidsekvenserne af individuelle fagtypning kloner identificeret ved DNA-sekvensering. Endelig blev de screenede peptider syntetiseret og analyseret for affinitet og biologisk aktivitet.
Fibroblast vækstfaktor receptorer (FGFRs) spille nøgleroller i celle proliferation, sårheling, og angiogenese i vivo1. Afvigende aktivering af fgfr signalering observeret i en række tumorer2,3,4,5 omfatter genforstærkning, genmutationer, kromosomale aberrationer, og overdreven ligand sekretion6 . Mange hæmmere rettet mod FGFRs har vist lovende terapeutiske virkninger i kliniske forsøg og er hovedsagelig klassificeret i tre typer: (1) små molekyle kinasehæmmere, som binder til det intracellulære domæne af FGFR, (2) antagonister, der er rettet mod ekstracellulært segment, og (3) FGF ligand fælder6. Selv om flere af de små molekyle kinasehæmmere har gode terapeutiske virkninger både in vitro og in vivo7, de fleste af dem har dårlig målspecificitet og viser bivirkninger såsom hypertension8. Flertallet af antagonister er monoklonale antistoffer9,10 og polypeptider11. Peptider har fordele i forhold til små molekyler på grund af deres specificitet og lavere bivirkninger. De bevarer også cellernes permeabilitet og ophobes ikke i specifikke organer sammenlignet med proteinstoffer12. Derfor, målrettede små peptider er både effektive og potentielle terapeutiske agenter.
Phage display teknologi er et nemt, men kraftfuldt værktøj til at identificere små peptider, som kan binde sig til et givet molekyle13,14,15. Vi brugte et fagtypning display peptid bibliotek, der er baseret på en simpel M13 fagtypning med over 109 forskellige peptidsekvenser vises i halen for binding til målet molekyle (Se tabel over materialer)16. På grund af den høje affinitet af fager mod det givne molekyle, ubundne fager kan vaskes væk, og kun stramt bundet fager med de ønskede korte peptider bevares. De givne molekylære mål kan være immobiliseret proteiner17,18, kulhydrater, dyrkede celler, eller endda uorganiske materialer19,20. En spændende sag blev rapporteret, hvor orgel-specifikke peptider blev valgt in vivo ved hjælp af fagtypning Display Technology21. Fordelene ved fagtypning display teknologi omfatter høj gennemløb, nem betjening, lave omkostninger og en bred vifte af applikationer22.
I denne undersøgelse giver vi en detaljeret protokol til screening af små peptider, der binder sig til det immobiliserede protein (FGFR2) ved hjælp af et fagtypning-skærm bibliotek. Teknologiens effektivitet undersøges også ved at måle affiniteten af det opnåede peptid mod FGFR2 ved isotermisk titrering Calorimetri (ITC) og den biologiske aktivitet ved en celle sprednings analyse. Metoden kan udvides til screening af små peptider, der binder til kulhydrater, dyrkede celler eller endda uorganiske materialer.
Et kombinatorisk fagtypning bibliotek er et kraftfuldt og effektivt værktøj til høj gennemløbs screening af nye peptider, der kan binde målmolekyler og regulere deres funktion13. I øjeblikket, fagtypning display peptid biblioteker har en bred vifte af applikationer. For eksempel kan de bruges til at vælge bioaktive peptider bundet til receptor proteiner23, ikke-protein mål24,25, sygdoms-specifikke antigen ef…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det videnskabelige og teknologiske program i Guangzhou (nr. 2016201604030039).
0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
-96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
96-well plate | Nest | 701001-2 | |
Agar | Beyotime | ST004D | |
Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
DMF | Newprobe | PB10247 | |
EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
IPTG | Beyotime | ST097 | |
ITC200 system | MicroCal Omega | ||
NaCl | Sigma | S6191 | |
NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
NaI | Bidepharm | BD40879 | |
NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
X-gal | Beyotime | ST912 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 |