Triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos Receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de Phage display
Summary
Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a seleção de peptídeos pequenos que se ligam a FGFR2 usando uma biblioteca de peptídeo de exibição de fago. Nós analisamos mais a afinidade dos peptídeos selecionados em direção a FGFR2 in vitro e sua capacidade de suprimir a proliferação celular.
Abstract
A família humana do receptor do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR) compreende quatro membros, a saber, FGFR1, FGFR2, FGFR3, e FGFR4, que são involvidos em várias atividades biológicas que incluem a proliferação, a sobrevivência, a migração e a diferenciação da pilha. Várias aberrações na via de sinalização FGFR, devido a mutações ou eventos de amplificação genética, foram identificadas em vários tipos de cânceres. Assim, pesquisas recentes têm focado no desenvolvimento de estratégias envolvendo direcionamento terapêutico de FGFRs. os inibidores atuais de FGFR em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e clínico incluem inibidores da molécula pequena de tirosina cinases ou anticorpos monoclonais, com apenas alguns inibidores à base de peptídeos no gasoduto. Aqui, fornecemos um protocolo usando a tecnologia de exibição de fago para triagem de pequenos peptídeos como antagonistas de FGFR2. Resumidamente, uma biblioteca de peptídeos exibidos com fago foi incubada em uma placa revestida com FGFR2. Subseqüentemente, o fago não acoplado foi lavado fora por TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), e o fago encadernado foi eluída com tampão de 0,2 M Glycine-HCl (pH 2,2). O fago eluída foi amplificado mais e usado como a entrada para a próxima rodada de biopanning. Depois de três círculos de biopanning, as seqüências do peptide de clones individuais do fago foram identificadas pelo sequenciamento do ADN. Finalmente, os peptídeos selecionados foram sintetizados e analisados quanto à afinidade e atividade biológica.
Introduction
Os receptores do fator de crescimento de fibroblastos (FGFRs) desempenham papéis-chave na proliferação celular, cicatrização de feridas e angiogênese in vivo1. A ativação aberrante da sinalização de FGFR observada em uma variedade de tumores2,3,4,5 inclui amplificação genética, mutações genéticas, aberrações cromossômicas e secreção excessiva de ligante6 . Muitos inibidores que visam o FGFRs mostraram efeitos terapêuticos promissores em ensaios clínicos e são principalmente classificados em três tipos: (1) inibidores da pequena molécula quinase, que se ligam ao domínio intracelular de FGFR, (2) antagonistas que visam a segmento extracelular e (3) armadilhas de ligantes FGF6. Embora diversos dos inibidores pequenos da quinase da molécula tenham bons efeitos terapêuticos in vitro e in vivo7, a maioria deles têm a especificidade pobre do alvo e mostram efeitos adversos tais como a hipertensão8. A maioria dos antagonistas são anticorpos monoclonais9,10 e polipeptídeos11. Peptídeos têm vantagens sobre pequenas moléculas devido à sua especificidade e efeitos colaterais inferiores. Eles também mantêm a permeabilidade celular e não se acumulam em órgãos específicos, em comparação com as drogas proteicas12. Assim, os pequenos peptídeos direcionados são agentes terapêuticos efetivos e prospectivos.
A tecnologia de display phage é uma ferramenta fácil, mas poderosa,para identificar pequenos peptídeos que podem se vincular a uma determinada molécula13,14,15. Nós usamos uma biblioteca do peptide da exposição do fago que seja baseada em um fago simples de M13 com sobre 109 seqüências diferentes do peptide indicadas na cauda para ligar à molécula do alvo (veja a tabela dos materiais)16. Devido à afinidade elevada dos fagos para a molécula dada, os fagos desligados podem ser lavados afastado, e somente os fagos firmemente limitados com os peptídeos curtos desejados são retidos. As metas moleculares dadas podem ser imobilizadas proteínas17,18, carboidratos, células cultivadas, ou até mesmo materiais inorgânicos19,20. Um caso emocionante foi relatado onde os peptídeos órgão-específicos foram selecionados in vivo usando a tecnologia da exposição do fago21. As vantagens da tecnologia da exposição do fago incluem a taxa de transferência elevada, a facilidade de operação, o baixo custo e uma escala larga das aplicações22.
Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado de triagem de peptídeos pequenos que ligam a proteína imobilizada (FGFR2) usando uma biblioteca de exibição de fago. A eficácia da tecnologia é examinada igualmente medindo a afinidade do peptide obtido para FGFR2 pela calorimetria de titulação isothermal (ITC), e pela atividade biológica por um ensaio da proliferação de pilha. O método pode ser estendido para a triagem de pequenos peptídeos que se ligam a carboidratos, células cultivadas, ou até mesmo materiais inorgânicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma biblioteca de fago combinatória é uma ferramenta poderosa e eficaz para a seleção da elevado-produção de peptídeos novos que podem ligar moléculas do alvo e regular sua função13. Atualmente, as bibliotecas do peptide do indicador do fago têm uma escala larga das aplicações. Por exemplo, eles podem ser usados para selecionar peptídeos bioativos vinculados a proteínas do receptor23, alvos não proteicos24,<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo programa de ciência e tecnologia de Guangzhou (n º 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
Riferimenti
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology – Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
