Screening och identifiering av små peptider riktade fibroblast tillväxtfaktor Receptor2 använda en phage display peptid bibliotek
Summary
Häri presenterar vi ett detaljerat protokoll för screening av små peptider som binder till FGFR2 med hjälp av en fagdisplay peptid bibliotek. Vi analyserar vidare Affiniteten hos de utvalda peptiderna mot FGFR2 in vitro och dess förmåga att undertrycka cellproliferation.
Abstract
Den mänskliga fibroblast tillväxtfaktor receptor (FGFR) familjen består av fyra medlemmar, nämligen, FGFR1, FGFR2, FGFR3, och FGFR4, som är involverade i olika biologiska aktiviteter inklusive cellproliferation, överlevnad, migration och differentiering. Flera avvikelser i FGFR signalvägen, på grund av mutationer eller genamplifiering händelser, har identifierats i olika typer av cancer. Den senaste forskningen har därför fokuserat på att utveckla strategier som involverar terapeutisk inriktning av FGFRs. aktuella FGFR-hämmare i olika stadier av preklinisk och klinisk utveckling omfattar antingen småmolekylära hämmare av tyrosinkinaser eller monoklonala antikroppar, med endast ett fåtal peptid-baserade hämmare i rörledningen. Här tillhandahåller vi ett protokoll som använder phage displayteknik för att avskärma små peptider som antagonister till FGFR2. Kortfattat, ett bibliotek med fagvisade peptider inkuberades i en tallrik belagd med FGFR2. Därefter spolades obunden phage av av TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), och destinerad phage eluerades med 0,2 M Glycine-HCl buffert (pH 2,2). Den eluerade Fagen förstärkallades ytterligare och användes som indata för nästa omgång biopanning. Efter tre omgångar av biopanning identifierades peptidsekvenserna av enskilda fagkloner med DNA-sekvensering. Slutligen, de screening peptider syntetiseras och analyseras för affinitet och biologisk aktivitet.
Introduction
Fibroblast tillväxtfaktor receptorer (FGFRs) spela viktiga roller i cellproliferation, sårläkning, och angiogenes in vivo1. Avvikande aktivering av FGFR-signalering observerades i en mängd olika tumörer2,3,4,5 inkluderar genamplifiering, genmutationer, kromosomala avvikelser, och överdriven ligand sekretion6 . Många hämmare som riktar sig mot FGFRs har visat lovande terapeutiska effekter i kliniska prövningar och är huvudsakligen indelade i tre typer: (1) små molekyl kinashämmare, som binder till den intracellulära domänen av FGFR, (2) antagonister riktade mot extracellulära segmentet och (3) FGF ligand-fällor6. Även om flera av de små molekylen kinashämmare har goda terapeutiska effekter både in vitro-och in vivo7, de flesta av dem har dålig mål specificitet och visar negativa effekter såsom hypertoni8. Majoriteten av antagonister är monoklonala antikroppar9,10 och polypeptider11. Peptider har fördelar jämfört med små molekyler på grund av deras specificitet och lägre biverkningar. De behåller också cellernas permeabilitet och ackumuleras inte i specifika organ jämfört med protein droger12. Därför riktade små peptider är både effektiva och prospektiva terapeutiska medel.
Phage displayteknik är ett enkelt men kraftfullt verktyg för att identifiera små peptider som kan binda till en given molekyl13,14,15. Vi använde en phage display peptid bibliotek som är baserad på en enkel M13 phage med över 109 olika peptid sekvenser visas på svansen för bindning till målmolekylen (se tabell över material)16. På grund av den höga affinitet av Fager mot den givna molekylen kan obundna Fager tvättas bort, och endast tätt bundna Fager med de önskade korta peptiderna behålls. De givna molekylära målen kan immobiliseras proteiner17,18, kolhydrater, odlade celler, eller till och med oorganiska material19,20. Ett spännande fall rapporterades där organspecifika peptider valdes in vivo med hjälp av phage displayteknik21. Fördelarna med phage displayteknik inkluderar hög genomströmning, enkel drift, låg kostnad och ett brett spektrum av applikationer22.
I denna studie ger vi ett detaljerat protokoll för screening små peptider bindning till immobiliserat protein (FGFR2) med hjälp av en fagdisplay bibliotek. Effekten av tekniken undersöks också genom att mäta Affiniteten hos den erhållna peptiden mot FGFR2 genom isotermisk titrering Calorimetri (ITC), och den biologiska aktiviteten genom en cell proliferation assay. Metoden kan förlängas för screening av små peptider som binder till kolhydrater, odlade celler, eller till och med oorganiska material.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett kombinatoriskt phage-bibliotek är ett kraftfullt och effektivt verktyg för hög genomflöde av nya peptider som kan binda målmolekyler och reglera deras funktion13. För närvarande, phage display peptid bibliotek har ett brett spektrum av applikationer. Till exempel, de kan användas för att välja bioaktiva peptider bundna till receptor proteiner23, icke-proteinmål24,25, sjukdomsspecifika antigen härmar<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det vetenskapliga och tekniska programmet i Guangzhou (nr 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
Riferimenti
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology – Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
