Screening og identifikation af små peptider rettet mod fibroblast vækstfaktor Receptor2 ved hjælp af et Phage display peptid bibliotek
Summary
Heri præsenterer vi en detaljeret protokol til screening af små peptider, der binder sig til FGFR2 ved hjælp af et fagtypning-display peptid-bibliotek. Vi analyserer yderligere affiniteten af de valgte peptider mod FGFR2 in vitro og dets evne til at undertrykke celle proliferation.
Abstract
Den humane fibroblast vækstfaktor receptor (FGFR) familie består af fire medlemmer, nemlig FGFR1, FGFR2, FGFR3 og FGFR4, der er involveret i forskellige biologiske aktiviteter, herunder celle spredning, overlevelse, migration og differentiering. Flere afvigelser i FGFR signalering pathway, på grund af mutationer eller genamplifikation hændelser, er blevet identificeret i forskellige typer af kræft. Nyere forskning har derfor fokuseret på at udvikle strategier, der involverer terapeutisk målretning af FGFRs. nuværende FGFR-hæmmere på forskellige stadier af præklinisk og klinisk udvikling omfatter enten små molekyle hæmmere af tyrosinkinaser eller monoklonalt antistoffer, med kun få peptidbaserede hæmmere i rørledningen. Her giver vi en protokol ved hjælp af fagtypning display teknologi til at screene små peptider som antagonister af FGFR2. Kort, et bibliotek af Phage-viste peptider blev inkuberet i en plade belagt med FGFR2. Efterfølgende blev ubundet fagtypning vasket af tbst (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), og bundet fagtypning blev elueret med 0,2 M Glycin-HCL buffer (pH 2,2). Den elueret fagtypning blev yderligere forstærket og anvendt som input til den næste runde af biopanning. Efter tre runder af biopanning blev peptidsekvenserne af individuelle fagtypning kloner identificeret ved DNA-sekvensering. Endelig blev de screenede peptider syntetiseret og analyseret for affinitet og biologisk aktivitet.
Introduction
Fibroblast vækstfaktor receptorer (FGFRs) spille nøgleroller i celle proliferation, sårheling, og angiogenese i vivo1. Afvigende aktivering af fgfr signalering observeret i en række tumorer2,3,4,5 omfatter genforstærkning, genmutationer, kromosomale aberrationer, og overdreven ligand sekretion6 . Mange hæmmere rettet mod FGFRs har vist lovende terapeutiske virkninger i kliniske forsøg og er hovedsagelig klassificeret i tre typer: (1) små molekyle kinasehæmmere, som binder til det intracellulære domæne af FGFR, (2) antagonister, der er rettet mod ekstracellulært segment, og (3) FGF ligand fælder6. Selv om flere af de små molekyle kinasehæmmere har gode terapeutiske virkninger både in vitro og in vivo7, de fleste af dem har dårlig målspecificitet og viser bivirkninger såsom hypertension8. Flertallet af antagonister er monoklonale antistoffer9,10 og polypeptider11. Peptider har fordele i forhold til små molekyler på grund af deres specificitet og lavere bivirkninger. De bevarer også cellernes permeabilitet og ophobes ikke i specifikke organer sammenlignet med proteinstoffer12. Derfor, målrettede små peptider er både effektive og potentielle terapeutiske agenter.
Phage display teknologi er et nemt, men kraftfuldt værktøj til at identificere små peptider, som kan binde sig til et givet molekyle13,14,15. Vi brugte et fagtypning display peptid bibliotek, der er baseret på en simpel M13 fagtypning med over 109 forskellige peptidsekvenser vises i halen for binding til målet molekyle (Se tabel over materialer)16. På grund af den høje affinitet af fager mod det givne molekyle, ubundne fager kan vaskes væk, og kun stramt bundet fager med de ønskede korte peptider bevares. De givne molekylære mål kan være immobiliseret proteiner17,18, kulhydrater, dyrkede celler, eller endda uorganiske materialer19,20. En spændende sag blev rapporteret, hvor orgel-specifikke peptider blev valgt in vivo ved hjælp af fagtypning Display Technology21. Fordelene ved fagtypning display teknologi omfatter høj gennemløb, nem betjening, lave omkostninger og en bred vifte af applikationer22.
I denne undersøgelse giver vi en detaljeret protokol til screening af små peptider, der binder sig til det immobiliserede protein (FGFR2) ved hjælp af et fagtypning-skærm bibliotek. Teknologiens effektivitet undersøges også ved at måle affiniteten af det opnåede peptid mod FGFR2 ved isotermisk titrering Calorimetri (ITC) og den biologiske aktivitet ved en celle sprednings analyse. Metoden kan udvides til screening af små peptider, der binder til kulhydrater, dyrkede celler eller endda uorganiske materialer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et kombinatorisk fagtypning bibliotek er et kraftfuldt og effektivt værktøj til høj gennemløbs screening af nye peptider, der kan binde målmolekyler og regulere deres funktion13. I øjeblikket, fagtypning display peptid biblioteker har en bred vifte af applikationer. For eksempel kan de bruges til at vælge bioaktive peptider bundet til receptor proteiner23, ikke-protein mål24,25, sygdoms-specifikke antigen ef…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det videnskabelige og teknologiske program i Guangzhou (nr. 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
Riferimenti
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology – Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
