Vi beskriver brugen af et nyt, frekvens-Domain luminescens livstids kamera til kortlægning af 2D O2 -distributioner med optiske sensor folier. Kamerasystemet og billedanalyse procedurerne beskrives sammen med forberedelsen, kalibreringen og anvendelsen af sensor folier til visualisering af O2 -mikromiljøet i rhizosfæren af vandplanter.
Vi beskriver en metode til at afbilde opløst ilt (O2), i 2D ved høj rumlig (< 50-100 μm) og tidsmæssig (< 10 s) opløsning. Metoden beskæftiger O2 følsomme lysende viser sensor folier (planar optodes) i kombination med en specialiseret kamerasystem til billeddannelse luminescens levetid i frekvens-domæne. Planar optodes fremstilles ved at opløse den O2-følsomme indikatorfarve i en polymer og sprede blandingen på en solid støtte i en defineret tykkelse via kniv belægning. Efter fordampning af opløsningsmidlet anbringes planar optode i tæt kontakt med prøven af interesse-her demonstreret med rødderne af vand planten Littorella uniflora. Den O2 koncentrationsafhængige ændring i luminescens levetid for indikator farven i planar optode er afbildet via bagsiden af den gennemsigtige bære folie og akvarie væggen ved hjælp af et særligt kamera. Dette kamera måler luminescens levetid (μs) via et skift i fase vinklen mellem et moduleret excitation-signal og et emissions signal. Denne metode er bedre end luminescens intensitet Imaging metoder, da signalet er uafhængig af farvestoffet koncentration eller intensitet af excitation kilde, og udelukkende er afhængig af luminescens forfald tid, som er en iboende refereret parameter. Der er derfor ikke behov for yderligere reference farve eller andre henvisnings midler. Vi demonstrerer brugen af systemet til makroskopisk O2 billeddannelse af plante jord stængkugler, men Kamerasystemet kan også nemt kobles til et mikroskop.
Fordelingen og dynamikken af opløste gasser og ioner i sedimenter og jord giver vigtige oplysninger om biogeokemiske processer såsom mikrobiel respiration1,2eller radial ilttab fra planterødder3,4,5og det kemiske mikromiljø af mikrober6,7, plante rhisfærer5,8,9 og dyre Burrows10, 11,12. Biologisk og kemisk aktivitet i sådanne diffusions begrænsede miljøer kan skabe stejle stigninger i kemiske substrater eller produkter af biogeokemiske processer. Især, O2 tilgængelighed har en enorm indflydelse på biogeokemiske processer og dermed biologi og økologi i et system13. Derfor, analysere O2 koncentrationer ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning er af afgørende betydning i akvatiske og terrestriske videnskaber. For det første blev der udviklet elektrokemiske og optiske mikrosensorer14,15 til måling af denne vigtige analysand. Senere, 2 dimensionelle (2D) billeddannelse af o2 med planar optodes blev introduceret12,16,17,18,19, som gjorde det muligt visualisering og kvantificering af heterogene O2 fordeling i jord og sedimenter.
Planar O2 optodes består af en O2-følsom indikatorfarve20, som opløses i en egnet polymer21. Indikatoren farvestof er spændt på specifikke optiske bølgelængder og udsender rødt forskudt lys ved afslapning i form af luminescens. I nærværelse af O2, kan den spændte indikatorfarve overføre sin energi til O2 molekyle ved kollision, som omtales som kollisions baseret luminescens dæmper22. Derfor reduceres luminescens intensitet og luminescens levetid med stigende O2 -koncentration23. I et ideelt tilfælde følger ændringen i intensitet og levetid den Stern-Volmer ligning (ligning 1) ved hjælp af enten luminescens intensitet eller levetid i fravær (i0; τ0) eller tilstedeværelse (i, τ) af O2 ved en given koncentration [Q]. Stern-Volmer-konstanten (KSV) er en målestok for optode-følsomheden mod O2; KSV er afhængig af miljøvariabler såsom temperatur og tryk.
1
Registrering af sådanne ændringer i luminescens over en planar sensor folie med et kamerasystem kan bruges til at visualisere de tilsvarende ændringer i O2 fordeling. I første omgang blev der anvendt en simpel luminescens intensitet-baseret O2 -afbildning18. Men, en sådan metode er meget følsom over for eksterne interferenser, som kompromitterer pålideligheden af resultaterne på grund af heterogene belysning, udsving i excitation kilde eller kamera, samt ujævn fordeling af indikatoren farvestof i planar optode.
Nogle af disse begrænsninger kan afhjælpes ved at anvende planar optodes til ratiometrisk billeddannelse17,24, hvor den o2-følsomme indikatorfarve er co-immobiliseret i polymer laget af planar optode med et ufølsomt reference farvestof, der udsender i et andet spektralområde end o2-indikatoren. Baseret på emissions billeder erhvervet i to spektral vinduer, det O2-følsomme emissions signal er divideret med reference signalet, genererer et forhold billede, der er mindre tilbøjelige til ovennævnte interferenser5,17. Metoden kræver brug af et andet farvestof, som ideelt set kan blive ophidset af den samme excitation kilde, men udsender på en anden bølgelængde (uden signifikant spektral overlap), i et andet spektral vindue af kameraet (f. eks, i en anden farvekanal af et RGB-kamera).
Alternativt kan O2 -billeddannelse baseres på kvantificering af o2-afhængig ændring i luminescens levetid for indikatorfarve stoffet, som ikke påvirkes af ujævn belysning eller heterogeniteter i indikator koncentrationen25. Første luminescens levetids baserede O2 -billedbehandlingssystemer var baseret på tidsdomæne målinger med et Gate-able opladet Device (CCD)-kamerasystem26, hvor der anvendes en pulserende excitation-kilde, og luminescens billeder tages over definerede tidsintervaller inden for excitation eller emission af indikatoren8,23,27. Fra sådanne billeder kan luminescens levetid bestemmes og korreleres til den tilsvarende O2 -koncentration i en kalibrering. Efterfølgende kan luminescens livstids billeder for en given prøve, der trykkes mod planar optode, konverteres til billeder af den tilsvarende 2D-fordeling af O2 -koncentrationen. Dette system er blevet anvendt i mange applikationer både i laboratoriet og in situ16,28, men det essentielle Gate-able CCD-kamera er ikke længere kommercielt tilgængeligt.
For nylig blev et andet luminescens livstids kamerasystem frigivet, som erhverver billeder i frekvens-domæne8. Systemet er afhængig af en kontinuerligt moduleret lyskilde til excitation. Dette kan enten være en sinusformet eller firkantet bølge i stedet for en pulserende excitation, som bruges til billed erhvervelse i tids domænet. Denne graduering resulterer i en moduleret luminescens emission af O2 -indikatorens farvestof, som er fase forskudt af en vinkel, φ, som er afhang af indikatorens luminescens levetid (τ) (Se ligning 2).
2
Ændringen mellem excitation og emission amplitude (dvs. det såkaldte modulations indeks eller dybde (amplitude divideret med den konstante luminescens del)) er også afhængig af luminescens levetid. Så ved at indstille en kendt modulationsfrekvens er den specielle CMOS-billedsensor i kameraet i stand til at måle luminescens levetid i NS til μs-området som beskrevet i detaljer andetsteds 8,29,30. En generel vejledning om Operations princippet kan findes (ved hjælp af følgende link https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).
I den følgende protokol viser vi brugen af det nye kamerasystem til billeddannelse fordelingen af O2 koncentration omkring rødderne af den akvatiske ferskvands plante littorella uniflora i 2D9,31. Vi vil gerne understrege, at denne metode på ingen måde er begrænset til denne applikation. Oxygen-følsomme optodes eller sensor partikler27 i kombination med forskellige billeddannelses metoder har været anvendt i medicinskforskning 32, i bioprinting33, for trykfølsommaling 34,35, eller at studere fotosyntetiske systemer2,36,37, bare for at nævne et par andre anvendelsesområder.
I denne protokol er hele arbejdsstrømmen fra optode Preparation til O2 billedanalyse dækket. Ved at følge denne protokol, kan kemiske billeder opnås ved hjælp af den nye frekvens-domæne-baserede luminescens levetid kamera. Afhængigt af applikationen kan planar optodes fremstilles i forskellige størrelser og lagtykkelse af sensor laget, der spænder fra robuste 50-100 μm tykke planar optodes af flere tiendedele af kvadratcentimeter til mikroskop Cover glider med < 1 μm tykke sensor lag6,40. Potentialet ved denne metode blev påvist med en bestemt anvendelse, men er ikke kun begrænset til O2 billeddannelse i plante rhisfærer12,28.
Denne metode har flere fordele i forhold til ren luminescens intensitetsbaserede kemiske billedbehandlings metoder. Luminescens levetid Imaging er ikke, eller i det mindste langt mindre, påvirket af ujævn belysning, ujævn optode tykkelse, og foto blegning25. Denne metode undgår også brugen af et yderligere reference farvestof, som er almindelig i ratiometrisk billeddannelse17,37. I sammenligning med andre Lifetime baserede kamerasystemer, såsom almindeligt anvendte gated time-Domain kameraer8,26, den nye kamerasystem og protokol præsenteret her kan levere sammenlignelige resultater. I en nylig publikation blev de analytiske karakteristika for disse to systemer sammenlignet, og det konstateredes, at det frekvens-domænebaserede luminescens livstids kamerasystem i det mindste kan sammenlignes med den udgåede tid-domænebaserede forgænger8.
Vi har præsenteret den enkleste O2 optode kun består af en indikator i en polymermatrix. Udover flere andre mulige O2 indikatorer20 , der kan anvendes tilsætningsstoffer kan medtages, dvs spredning agenter såsom TiO2 eller Diamond Powder2 at øge sensor signal samtidig reducere gennemsigtigheden af optode. Yderligere farvestoffer kan også bruges til at forbedre signal intensiteten via energioverførsel41.
For planar optode fabrikation anbefaler vi at bruge et hul i kniv-belægnings anordningen på 75-120 μm til at give en endelig sensor lagtykkelse på ca. 7,5 til 12 μm efter fordampning af opløsningsmiddel (ca. 10% af det anvendte hul), når den beskrevne sensor cocktail sammensætning anvendes. Dette er et godt kompromis mellem signalintensitet, som kan ændres ved højere farvestof lastning, eller ved at vælge indikator og reference farvestoffer af højere lysstyrke, og responstid. En forøgelse af lagtykkelsen resulterer i en stigning i responstid, da det tidsrum, der kræves, for at analytten kan nå en termodynamisk ligevægt i det følende lag med de omgivende medier, stiger12.
Optodes, som beskrevet her, reagerer på ændringer i O2 koncentrationen inden for få sekunder17 , mens der stadig er et tilstrækkeligt stærkt luminescens signal. Ultratynde sensor belægninger med sub-sekund responstider kan realiseres med spin-coating6. Hvis støtte-eller kniv belægnings anordningen ikke er velrengjort, kan det resultere i inhomogene sensor lag. Også, når cocktailen ikke er helt homogen eller anvendes for hurtigt efter spredning foran belægningen anordning sådan et uønsket resultat kan observeres. Derfor, det kan have brug for nogle praksis til at forberede optimale optodes.
Metoden kan bruges til at billed prøver, som kan sættes i tæt kontakt til optode, såsom visse Marine dyr42, biofilm6 og jord31 bare for at nævne nogle få. Vi præsenterer en standalone setup ved hjælp af et mål, men kameraet kan nemt kobles til et mikroskop for højere opløsning kemisk billeddannelse43.
Mens tids domænebaseret luminescens levetid Imaging aktiveret undertrykkelse af baggrunden fluorescens26, dette er et problem, når du bruger den nye frekvens-domæne-baserede kamerasystem8. På grund af den kontinuerlige billed erhvervelse, vil dette kamera optage enhver baggrunds fluorescens af prøven, der kan blive ophidset af den valgte LED og udsender i det valgte spektral vindue som defineret af emissions filteret på kameraets mål. Dette vil resultere i en tilsyneladende lavere levetid og dermed i falske aflæsninger. Hvis du arbejder med prøver med en signifikant iboende fluorescens overlapning med O2 sensor excitation og emission, er det vigtigt at anvende en ekstra optisk isolering på toppen af optode, ved belægning et ekstra lag indeholdende Carbon Black2,17. Således vil kun luminescens udsendt fra planar optode nå kameraet. For at kontrollere baggrunds luminescens kan der tages et billede uden optode, som så udelukkende ville vise prøvens iboende luminescens. Det er også muligt at tilføje spredning agenter såsom TiO2 eller Diamond Powder2,44, til sensoren cocktail, at øge luminescens intensitet af indikatoren farvestof. Dette kan dog også føre til hurtigere foto blegning og TiO2 er en kendt foto-katalysator, som kan forringe foto stabilitet af et farvestof41. Et andet aspekt at overveje, er baggrundslys. Ved billeddannelse af luminescens levetid skal baggrundslyset undgås så effektivt som muligt. Derfor kræver denne billedbehandlings metode, at opsætningen placeres i et mørkt miljø, og at enhver ekstern lyskilde skal slukkes midlertidigt under billed anskaffelsen.
Kort sagt er luminescens livstids Imaging en robust kemisk billedbehandlings metode, der kan tilpasses til mange forskellige anvendelser. Denne protokol (Se afsnit 1-5) dækker alle de væsentlige trin til at generere en O2 billede og bruger den aktuelt mest fleksible frekvens-domæne luminescens levetid Imaging system, som kan erstatte den ophørte gated tids domæne kamera til 2D O2 Imaging med planar optodes.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Sofie Lindegaard Jakobsen (Københavns Universitet) og Lars Borregaard Pedersen (Aarhus Universitet) for teknisk assistance. Finansieringen af denne undersøgelse blev hentet fra et avanceret tilskud fra Sapere-Aude fra den uafhængige forskningsfond Danmark (DFF-1323-00065B; MK), projekttilskud fra den uafhængige forskningsfond Danmark | Naturvidenskab (DFF-8021-00308B; MK) & tekniske og produktionsteknikker (DFF-8022-00301B og DFF-4184-00515B; ), Danmarks National Research Foundation (DNRF136) og Poul Due Jensen Foundation (KK).
Air pump with air stone and water pump | Local aquarium store | ||
Chloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
DC4 silicone compound | Dow Corning GmbH | 2793695 | |
Gas mixer | Vögtlin Instruments GmbH | red-y compact meter GCM | This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices |
Glass plates and aquaria | Local aquarium or hardware store | ||
ImageJ Software | ImageJ | Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html) | |
Knife-coating device | BYK-GARDNER GMBH byk.com |
2021 | This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation. |
LED lamp, Reflector PAR38 | Megaman | MM17572 | |
LED LEDHUB | Omicon Laserage, Germany | Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential | |
LOCTITE AA 3494 | Henkel AG & Co. KGaA | NA | Acrylic-based instant adhesive |
NIS Elements AR Software | Nikon Inc | Software package used for image acquisition | |
pco.flim | PCO AG, Germany | Frequency domain based luminescence lifetime camera | |
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) | Frontier Scientific | PtT975 | O2 indicator |
polyethylene terephthalate (PET) foil | Goodfellow | 320-992-72 | Such foils might also be found from other providers and serve as solid support |
Polystyrene (PS) | Sigma Aldrich | 9003-53-6 | Polymer matrix |
Schott RG610 filter | www.uviroptics.com | Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective | |
Vinyl electrical tape | Scotch, Super 33+ | NA | |
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor | delivered with the camera | Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount |