Vi beskriver bruken av en roman, frekvens-domene luminescence livstids kamera for kartlegging 2D O2 distribusjoner med optisk sensor folier. Kamera system og bildeanalyse prosedyrer er beskrevet sammen med utarbeidelse, kalibrering og anvendelse av sensor folier for å visualisere O2 mikromiljøet i rhizosphere av vannplanter.
Vi beskriver en metode for å avbilde oppløst oksygen (O2), i 2D ved høy romlig (< 50-100 μm) og temporal (< 10 s) oppløsning. Metoden sysselsetter O2 følsom selvlysende sensor folier (Planar optodes) i kombinasjon med et spesialisert kamera system for Imaging luminescence levetid i frekvens-domene. Planar optodes er utarbeidet ved å oppløse O2-sensitive indikatorfarge stoff i en polymer og spre blandingen på en solid støtte i en definert tykkelse via kniv belegg. Etter fordampning av løsemiddel, er den Planar optode plassert i nær kontakt med prøven av interesse-her demonstrert med røttene av vann anlegget Littorella uniflora. O2 konsentrasjon-avhengig endring i luminescence levetid av indikatoren fargestoff innenfor Planar optode er avbildet via baksiden av gjennomsiktig bærer folie og akvarium veggen ved hjelp av et spesielt kamera. Dette kameraet måler luminescence levetid (μs) via en forskyvning i fasevinkelen mellom et modulert eksitasjon signal og utslipps signal. Denne metoden er overlegen luminescence intensitet Imaging metoder, som signalet er uavhengig av fargestoff konsentrasjon eller intensiteten av eksitasjon kilden, og utelukkende er avhengig av luminescence forfall tid, som er en ubetinget referert parameter. Følgelig, en ekstra referanse fargestoff eller andre former for henvisning er ikke nødvendig. Vi viser bruken av systemet for makroskopisk O2 Imaging av anlegget rhizospheres, men kameraet systemet kan også enkelt kobles til et mikroskop.
Fordelingen og dynamikken i oppløste gasser og ioner i sedimenter og jord gir viktig informasjon om biokjemiske prosesser som mikrobiell åndedrett1,2, eller radial oksygen tap fra planterøtter3,4,5, og den kjemiske mikromiljøet av mikrober6,7, plante rhizospheres5,8,9 og Animal Burrows10, 11,12. Biologisk og kjemisk aktivitet i slike diffusjon-begrensede miljøer kan skape bratte graderinger av kjemiske underlag eller produkter av biokjemiske prosesser. Spesielt har O2 tilgjengelighet en stor innvirkning på biokjemiske prosesser og dermed biologi og økologi av et system13. Derfor er det å analysere O2 konsentrasjoner ved høy romlig og timelig resolusjon av førsteklasses betydning i akvatiske og terrestriske vitenskaper. Først ble elektrokjemiske og optisk mikrosensorer14,15 utviklet for å måle denne viktige analytt. Senere, 2 dimensjonale (2D) Imaging av O2 med Planar optodes ble innført12,16,17,18,19, som aktiverte visualisering og kvantifisering av heterogen O2 distribusjon i jord og sedimenter.
Planar O2 optodes består av en O2-følsom indikatorfarge stoff20, som er oppløst i en passende polymer21. Indikatoren fargestoff er spent på bestemte optiske bølgelengder og avgir rød-forskjøvet lys ved avslapping i form av luminescence. I nærvær av O2, den spent indikatorfarge stoff kan overføre sin energi til O2 molekylet ved kollisjon, som er referert til som kollisjon-baserte luminescence slukke22. Derfor reduseres luminescence intensitet og luminescence levetid med økende O2 konsentrasjon23. I et ideelt tilfelle endringen i intensitet og levetid følger Stern-volmer ligningen (ligning 1) ved hjelp av enten luminescence intensitet eller levetid i fravær (I0; τ0) eller tilstedeværelse (i, τ) av O2 ved en gitt konsentrasjon [Q]. Stern-volmer-konstanten (KSV) er et mål for følsomheten til Optode mot O2; KSV er avhengig av miljøvariabler som temperatur og trykk.
1
Opptak slike endringer i luminescence over en Planar sensor folie med et kamera system kan brukes til å visualisere de tilsvarende endringene i O2 Distribution. I utgangspunktet ble enkle luminescence intensitet-baserte O2 Imaging brukt18. Imidlertid er slik metodikk svært følsom for ytre forstyrrelser, som kompromiss påliteligheten av resultatene på grunn av heterogen belysning, svingninger i eksitasjon kilde eller kamera, samt ujevn fordeling av indikatorfarge stoff innenfor Planar optode.
Noen av disse begrensningene kan lindres ved hjelp av Planar optodes for ratiometrisk Imaging17,24, der o2-følsom indikatorfarge stoff er co-immobilisert i polymer laget av Planar optode med en ufølsom referanse fargestoff emitting i en annen Spectral rekkevidde enn O2-indikator. Basert på utslipps bilder ervervet i to Spectral Windows, er O2-sensitive utslipp signal delt av referanse signalet, genererer et forhold bilde som er mindre utsatt for ovennevnte forstyrrelser5,17. Metoden krever bruk av en andre fargestoff, som ideelt sett kan bli begeistret av den samme eksitasjon kilde, men avgir en annen bølgelengde (uten signifikant Spectral overlapping), i en annen Spectral vindu av kameraet (f. eks, i en annen fargekanal på et RGB kamera).
Alternativt kan O2 Imaging baseres på kvantifisere o2-avhengig endring i luminescence levetid for indikatorfarge, som ikke påvirkes av ujevn belysning eller heterogeniteter i indikator konsentrasjonen25. Første luminescence livstids BAS ertO 2 Imaging-systemer var basert på tids domene målinger med en gate-stand ladet koblet enhet (CCD) kamera system26, hvor en pulserende eksitasjon kilde brukes og luminescence bilder er tatt over definerte tidsintervaller innenfor eksitasjon eller utslipp av indikatoren8,23,27. Fra slike bilder, kan luminescence levetid fastsettes og korrelert til tilsvarende O2 konsentrasjon i en kalibrering. Deretter kan luminescence livstids bilder for et gitt utvalg presset mot Planar optode konverteres til bilder av den tilsvarende 2D-fordelingen av O2 -konsentrasjonen. Denne system er blitt anvendt inne mange søknadene begge to inne laboratoriet og inne situ16,28, bortsett fra det vesentlige gate-dugelig CCD kameraet er ikke lenger kommersielt anvendelig.
Nylig ble en annen luminescence levetid kamera systemet lansert, som kjøper bilder i frekvens-domene8. Systemet er avhengig av en kontinuerlig modulert lys kilde for eksitasjon. Dette kan enten være en sinusformet eller firkantet bølge i stedet for en pulserende eksitasjon, som brukes til bildeoppkjøp i tids domenet. Dette modulering resulterer i en modulert luminescence utslipp av O2 indikatorfarge stoff, som er fase-forskjøvet ved en vinkel, φ, som er avhengig av luminescence levetid av indikatoren fargestoff (τ) (se ligning 2).
2
Endringen mellom eksitasjon og utslipps amplitude (dvs. den såkalte modulerings indeksen eller dybden (amplitude delt på den konstante luminescence delen)) er også avhengig av luminescence levetid. Så, ved å sette en kjent modulering frekvens den spesielle CMOS bildesensor i kameraet er i stand til å måle luminescence levetid i NS til μs rekkevidde som beskrevet i detalj andre steder 8,29,30. En generell veiledning om operasjonen prinsippet kan bli funnet (ved hjelp av følgende link https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).
I følgende protokoll, viser vi bruk av romanen kamera system for Imaging fordelingen av O2 konsentrasjon rundt røttene av akvatiske ferskvann anlegget Littorella uniflora i 2D9,31. Vi ønsker å understreke at denne metoden er på ingen måte begrenset til dette programmet. Oksygen følsomme optodes eller sensor partikler27 i kombinasjon med ulike Imaging metoder har blitt brukt i medisinsk forskning32, i bioprinting33, for trykkfølsomme malinger34,35, eller å studere fotosyntetiske systemer2,36,37, bare for å nevne noen andre felt av programmet.
I denne protokollen er hele arbeidsflyten fra optode forberedelser til O2 bildeanalyse dekket. Ved å følge denne protokollen, kan kjemiske bilder fås ved hjelp av romanen frekvens-domene-baserte luminescence livstids kamera. Avhengig av programmet, Planar optodes kan være fabrikkert i ulike størrelser og lag tykkelse på sensor laget fra robuste 50-100 μm tykk Planar optodes av flere tiendedeler av kvadratcentimeter til mikroskop dekke slips med < 1 μm tykk sensor lag6,40. Potensialet i denne metoden ble demonstrert med en spesiell anvendelse, men er ikke bare begrenset til O2 Imaging ianlegget rhizospheres.
Denne metoden har flere fordeler sammenlignet med ren luminescence intensitet-baserte kjemiske Imaging metoder. Luminescence levetid Imaging er ikke, eller i det minste langt mindre, påvirket av ujevn belysning, ujevn optode tykkelse, og foto bleking25. Dessuten unngår denne metoden bruk av en ekstra referanse fargestoff vanlig i ratiometrisk Imaging17,37. I forhold til andre levetid basert kamera systemer, for eksempel brukte gated time-domene kameraer8,26, romanen kamera system og protokoll som presenteres her kan levere sammenlignbare resultater. I en fersk publikasjon ble de analytiske egenskapene til de to systemene sammenlignet, og det ble funnet at frekvens-domene-basert luminescence livstids kamera system er minst sammenlignbare med den utgåtte tids domenebasert forgjenger8.
Vi har presentert den enkleste O2 optode bestående bare av en indikator i en polymer matrise. Foruten flere andre mulige O2 indikatorer20 som kan brukes tilsetningsstoffer kan inkluderes, dvs., spredning agenter som TiO2 eller diamantpulver2 for å øke sensor signal samtidig redusere gjennomsiktigheten av optode. Også flere fargestoffer kan brukes til å forbedre signal intensiteten via energi overføring41.
For Planar optode fabrikasjon, anbefaler vi å bruke et gap i kniv-belegg enhet av 75-120 μm å gi en endelig sensor lag tykkelse på rundt 7,5 til 12 μm etter løsemiddel fordampning (rundt 10% av brukt gap), når du bruker den beskrevne sensoren cocktail komposisjon. Dette er et godt kompromiss mellom signal intensitet, som kan endres ved høyere fargestoff lasting, eller ved å velge indikator og referanse fargestoffer av høyere lysstyrke, og responstid. En økning i lag tykkelse resulterer i en økning i responstid, som tidsrommet som er nødvendig for analytt å nå en termodynamisk likevekt i sensing laget med omkringliggende medier øker12.
Optodes, som beskrevet her, reagerer på endringer i O2 konsentrasjon innen noen få sekunder17 , mens fortsatt har et tilstrekkelig sterkt luminescence signal. Ultratynne sensor belegg med sub-sekunders responstid kan realiseres med spin-belegg6. Hvis støtte eller kniv belegg enheten ikke er godt rengjort, kan det føre til inhomogen sensor lag. Også når cocktail er ikke helt homogen eller påføres for raskt etter spredning foran belegget enheten slik en uønsket resultat kan observeres. Derfor kan det trenge litt øvelse å forberede optimal optodes.
Metoden kan brukes til bilde prøver som kan settes i nær kontakt til optode, for eksempel visse marine dyr42, biofilm6 og jord31 bare for å nevne noen. Vi presenterer et frittstående oppsett ved hjelp av en objektiv, men kameraet kan enkelt kobles til et mikroskop for høyere oppløsning kjemisk Imaging43.
Stund tid-domenen basert luminescence levetid tenkelig satt i stand til undertrykkelse av miljøet fluorescens26, denne er en utsendelse når benytter det ny hyppigheten-domenen-basert kameraet system8. På grunn av den kontinuerlige bilde oppkjøpet, vil dette kameraet registrere eventuelle bakgrunns fluorescens av prøven som kan bli opphisset av den valgte LED og avgir i den valgte Spectral vinduet som definert av utslipps filteret på kameraet målet. Dette vil resultere i en tilsynelatende lavere levetid og følgelig i falske avlesninger. I tilfelle du arbeider med prøver med en betydelig iboende fluorescens overlapper med O2 sensor eksitasjon og utslipp, er det viktig å bruke en ekstra optisk isolasjon på toppen av optode, ved å belegg et ekstra lag som inneholder Carbon Black2,17. Således, bare luminescence utsendt fra det Planar optode ville rekkevidde kameraet. For å se etter bakgrunn luminescence et bilde uten optode kan tas, som da ville utelukkende viser iboende luminescence av prøven. Det er også mulig å legge til spredning agenter som TiO2 eller diamantpulver2,44, til sensoren cocktail, for å øke luminescence intensitet av indikatorfarge stoff. Men dette kan også føre til raskere Foto bleking og TiO2 er en kjent Foto-katalysator, som kan svekke photostability av et fargestoff41. Et ytterligere aspekt å vurdere er bakgrunnslys. Når Imaging luminescence levetid, bakgrunnslys må unngås så effektivt som mulig. Derfor krever denne bildebehandlings metoden at oppsettet plasseres i et mørkt miljø, og at en ekstern lyskilde må slås av midlertidig under bildeinnhenting.
Oppsummert er luminescence livstidsprevalens en robust kjemisk bildebehandlings metode som kan tilpasses mange forskjellige bruksområder. Denne protokollen (se avsnitt 1-5) dekker alle de grunnleggende trinnene for å generere en O2 bilde og bruker tiden mest fleksible frekvens-domene luminescence levetid Imaging system, som kan erstatte nedlagte gated time-domene kamera for 2D O2 Imaging med Planar optodes.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Sofie Lindegaard Jakobsen (Universitetet i København) og Lars Borregaard Pedersen (Aarhus universitet) for teknisk assistanse. Finansiering for denne studien ble innhentet fra en Sapere-Aude avansert stipend fra det uavhengige forskningsfondet Danmark (DFF-1323-00065B; MK), prosjekt bevilgninger fra Independent Research Fund Danmark | Naturvitenskap (DFF-8021-00308B; MK) & tekniske og produksjons vitenskaper (DFF-8022-00301B og DFF-4184-00515B; MK), den danske nasjonal forskningsstiftelse (DNRF136), og Poul Due Jensen Foundation (KK).
Air pump with air stone and water pump | Local aquarium store | ||
Chloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
DC4 silicone compound | Dow Corning GmbH | 2793695 | |
Gas mixer | Vögtlin Instruments GmbH | red-y compact meter GCM | This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices |
Glass plates and aquaria | Local aquarium or hardware store | ||
ImageJ Software | ImageJ | Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html) | |
Knife-coating device | BYK-GARDNER GMBH byk.com |
2021 | This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation. |
LED lamp, Reflector PAR38 | Megaman | MM17572 | |
LED LEDHUB | Omicon Laserage, Germany | Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential | |
LOCTITE AA 3494 | Henkel AG & Co. KGaA | NA | Acrylic-based instant adhesive |
NIS Elements AR Software | Nikon Inc | Software package used for image acquisition | |
pco.flim | PCO AG, Germany | Frequency domain based luminescence lifetime camera | |
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) | Frontier Scientific | PtT975 | O2 indicator |
polyethylene terephthalate (PET) foil | Goodfellow | 320-992-72 | Such foils might also be found from other providers and serve as solid support |
Polystyrene (PS) | Sigma Aldrich | 9003-53-6 | Polymer matrix |
Schott RG610 filter | www.uviroptics.com | Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective | |
Vinyl electrical tape | Scotch, Super 33+ | NA | |
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor | delivered with the camera | Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount |