हम कंकाल की मांसपेशियों की कार्डियोटॉक्सिन मध्यस्थता चोट और एक आत्म देने siRNA के इंजेक्शन का उपयोग करके उपग्रह कोशिकाओं में एक विशिष्ट जीन के कार्यात्मक नुकसान की जांच करने के लिए एक विवो विधि में वर्णन.
कंकाल की मांसपेशी चोट के बाद पुनर्जीवित करने के लिए एक विशाल क्षमता के पास. इस प्रक्रिया को मुख्य रूप से मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं द्वारा संचालित है, यह भी उपग्रह कोशिकाओं कहा जाता है. सैटेलाइट कोशिकाओं प्रतिलेखन कारक Pax7 की अभिव्यक्ति और आराम कंकाल की मांसपेशी में बेसल पटल के नीचे उनके स्थान की विशेषता है. चोट पर, उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय हो, स्वयं नवीनीकरण या भेदभाव से गुजरना या तो नए मायोफाइबर फार्म या क्षतिग्रस्त लोगों के साथ फ्यूज करने के लिए. विवो में उपग्रह कोशिकाओं की कार्यक्षमता कंकाल की मांसपेशियों के एक cardiotoxin आधारित चोट मॉडल का उपयोग कर जांच की जा सकती है. कंकाल की मांसपेशी के पुनर्जनन के दौरान एक जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल ज्यादातर उपयोग किया जाता है. यहाँ, हम ट्रांसजेनिक चूहों के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रस्तुत, पुनर्जनन के दौरान उपग्रह कोशिकाओं में जीन समारोह की जांच करने के लिए, उदा, मामलों में जहां ट्रांसजेनिक चूहों उपलब्ध नहीं हैं. हम एक विशिष्ट कंकाल की मांसपेशियों के carditoxin मध्यस्थता चोट regenerating मांसपेशी जो तो अन्य कोशिकाओं के बीच उपग्रह कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है में एक आत्म देने siRNA के इंजेक्शन के साथ गठबंधन. इस तरह, हम ट्रांसजेनिक चूहों की आवश्यकता के बिना शारीरिक स्थितियों के तहत पुनर्जनन के दौरान उपग्रह कोशिकाओं में जीन समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं।
कंकाल की मांसपेशी शरीर का सबसे बड़ा ऊतक है जो स्वैच्छिक चलन को सक्षम करने वाले कुल शरीर के वजन का लगभग 40% का प्रतिनिधित्व करता है। कंकाल की मांसपेशी के ऊतक वास्तुकला मुख्य रूप से postmitotic से बना है, टर्मिनल विभेदित, multinucleated myofibers के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परिधीय तंत्रिका तंत्र से विभिन्न अन्य कोशिकाओं, संवहनी प्रणाली, और अंतरालीय कोशिकाओं1. महत्वपूर्ण बात, कंकाल की मांसपेशी को पुनर्जीवित करने और चोट या क्षति2पर समारोह बहाल करने के लिए एक जबरदस्त क्षमता है। यह प्रक्रिया ऊतक निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं पर निर्भर करती है जिसे उपग्रह कोशिकाएं3,4 भी कहा जाताहै. उपग्रह कोशिकाओं मायोफाइबर और बेसल पटल के बीच स्थित हैं और प्रतिलेखन कारक Pax75,6,7की अभिव्यक्ति की विशेषता है . होमोस्टेटिक परिस्थितियों के तहत, उपग्रह कोशिकाएं शांत होती हैं लेकिन दर्दनाक चोट के कारण सक्रिय हो जाती हैं, जैसे, सनकी व्यायाम के माध्यम से या प्रायोगिक रूप से सांप विष कार्डियोटॉक्सिन6,8के इंजेक्शन के माध्यम से। एक बार सक्रिय, Pax7 सकारात्मक उपग्रह कोशिकाओं सह एक्सप्रेस MyoD और Myf5, जो स्टेम कोशिकाओं myogenic भेदभाव करने के लिए प्रतिबद्ध है. सैटेलाइट सेल जो प्रतिबद्धता कारकों के विनियमन का विरोध करते हैं, वे अपनी स्टेमनेस क्षमता को बनाए रखेंगे और भविष्य की मांगों के लिए स्टेम सेल पूल को भरने के लिए शांत हो जाएंगे। myogenic जनक पूल के विस्तार के बाद, ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क Myogenin जैसे भेदभाव कारकों द्वारा सक्रिय कर रहे हैं सेल चक्र से बाहर निकलें और टर्मिनल भेदभाव आरंभ करने के लिए. ये मायोप्रोजेनिटर्स तो एक दूसरे के लिए फ्यूज या मौजूदा myofibers myonuclei योगदान करने के लिए मायोन्यूक्लियर डोमेन के आकार को बनाए रखने के लिए. मायोफाइबर्स मायोसिन हैवी चेन जैसे टर्मिनल मांसपेशी विभेद जीन ों को व्यक्त करते हैं। अंत में, नवगठित मायोफाइबर बढ़ते हैं और कंकाल की मांसपेशी9,10की कार्यात्मक इकाइयों का निर्माण करने के लिए परिपक्व होते हैं।
कंकाल की मांसपेशी के पुनर्जनन मांसपेशियों की बीमारियों या उम्र बढ़ने सहित विभिन्न स्थितियों से प्रभावित किया जा सकताहै 11,12, हल्के हानि से जीवन की धमकी की स्थिति को लेकर, जैसे, Duchenne मांसपेशियों dystrophy13 में , 14. इसलिए , पुनर्योजी चिकित्सा का उद्देश्य उपग्रह सेल फंक्शन15,16को लक्षित करके अपनी अंतर्निहित पुनर्योजी शक्ति का उपयोग करके क्षतिग्रस्त या खराब कंकाल ीय ऊतकों को बहाल करना है . अपनी पूरी क्षमता का उपयोग करने के लिए कंकाल की मांसपेशी के पुनर्जनन के दौरान उनके अंतर्जात आला में उपग्रह कोशिकाओं की एक व्यापक समझ की आवश्यकता है. हालांकि प्रयोगात्मक दृष्टिकोण उनके मायोफाइबर17के निकट उपग्रह कोशिकाओं को अलग करने के लिए मौजूद हैं, उनके पर्यावरण के साथ उपग्रह कोशिकाओं के सेलुलर और प्रणालीगत बातचीत की पूरी जटिलता केवल विवो में recapitulated किया जा सकता है. इस संबंध में, कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन के बारे में महान ज्ञान माउस चोट मॉडल2,18का उपयोग कर प्राप्त किया गया है.
यहाँ हम एक विशिष्ट प्रयोगात्मक माउस चोट मॉडल परिचय के लिए कार्डियोटॉक्सिन के स्टेम सेल मध्यस्थता पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए प्रेरित tibialis पूर्वकाल मांसपेशी vivo में. कार्डियोटॉक्सिन, एक सांप व्युत्पन्न साइटोलिटिक विष जो मायोफाइबर depolarization और नेक्रोसिस का कारण बनता है, tibialis पूर्वकाल मांसपेशी में इंजेक्ट किया जाता है, जो बदले में ऊतक अध: पतन के बाद ट्रिगर करेगा। तीव्र पुनर्जनन के दौरान जीन के समारोह का विश्लेषण करने के लिए, आत्म वितरण siRNAs चोट के बाद 3 दिन में इंजेक्शन हैं, उपग्रह सेल विस्तार के शिखर पर. प्रायोगिक जानवरों को विभिन्न समय बिंदुओं पर बलिदान किया जाता है और टिबियालिस पूर्वकाल की मांसपेशियों को एकत्र किया जाता है। विच्छेदित पेशियां जमे हुए हैं और आगे क्रायो-सेक्शनिंग के लिए संसाधित की जाती हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग फिर पुनर्जनन के मार्करों का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। इस विधि जंगली प्रकार चूहों का उपयोग कर कंकाल की मांसपेशियों के उपग्रह सेल संचालित पुनर्जनन के दौरान एक जीन के समारोह की जांच के लिए अनुमति देता है.
यहाँ हम ट्रांसजेनिक जानवरों की आवश्यकता के बिना कंकाल की मांसपेशियों के पुनर्जनन के दौरान एक विशिष्ट जीन के समारोह की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह चोट के बाद दिन 3 में regenerating कंकाल की मांसपेशी में एक आत्म देने siRNA के इंजेक्शन के साथ carditoxin प्रेरित मांसपेशियों की चोट के संयोजन से पूरा किया है. हम विस्तार से carditoxin द्वारा मांसपेशियों की चोट की प्रक्रियाओं का वर्णन किया है, स्वयं देने siRNA और पुनर्जनन की प्रगति का विश्लेषण करने के लिए काटा मांसपेशियों के प्रसंस्करण के इंजेक्शन. हम प्रदर्शित करते हैं कि कंकाल की मांसपेशी में सांप विष कार्डियोटॉक्सिन का इंजेक्शन प्रभावी ढंग से पूरी मांसपेशियों को घायल करता है और यह कि आत्म-वितरण siRNAs अन्य सेल प्रकार के बीच सभी उपग्रह कोशिकाओं के लगभग 75% में पाए जाते हैं दो दिन के बाद उनके इंजेक्शन में पुन: उत्पन्न कंकाल की मांसपेशी (चित्र 4, चित्र 5) ।
विशेष ध्यान tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों की एक सजातीय चोट पर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए के बाद से चोट के विभिन्न डिग्री पुनर्जनन परिणाम को प्रभावित और इस तरह भी siRNA के प्रभाव को प्रभावित किया जा सकता है. इसके अलावा, यह गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि पूरे regenerating क्षेत्र स्वयं देने siRNA के साथ इंजेक्शन है. पुनर्जनन प्रक्रिया के विश्लेषण के लिए, यह हमेशा regenerating कंकाल की मांसपेशी के समान क्षेत्रों की तुलना करने के लिए सिफारिश की है, इसलिए, tibialis पूर्वकाल मांसपेशी हमेशा मांसपेशियों के मध्य बेली क्षेत्र की तुलना करने के लिए आधे में कटौती की जानी चाहिए. मांसपेशियों का विश्लेषण करते समय, पूरे cryosection का विश्लेषण किया जाना चाहिए क्योंकि मायोफाइबर संरचना tibialis पूर्वकाल की मांसपेशियों में अलग है और इसलिए अलग ढंग से पुनर्जीवित हो सकता है।
उपग्रह कोशिकाओं के समारोह आसन्न अलग एकल myofibers17पर उनकी संस्कृति सहित विभिन्न प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं द्वारा जांच की जा सकती है , प्रत्यारोपण द्वारा और प्रेरित चोट के बाद कंकाल की मांसपेशियों के पुनर्जनन का विश्लेषण करके 18,19. एक में vivo प्रेरित चोट मॉडल का उपयोग करके उपग्रह कोशिकाओं के समारोह की जांच, जैसे, carditoxin के इंजेक्शन, ऐसे मैक्रोफेज के रूप में अन्य सेल प्रकार के साथ उनकी बातचीत के मामले में भी उपग्रह सेल समारोह का विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करता है और प्रणालीगत कारकों के प्रभाव की जांच2. कंकाल की मांसपेशी की चोट विभिन्न साधनों से पूरा किया जा सकता है, जैसे, सनकी व्यायाम, फ्रीज चोट, BaCl2 का इंजेक्शन या इस तरह के कार्डियोटॉक्सिन या नोटेक्सिन18के रूप में सांप के जहर का इंजेक्शन। जबकि सनकी व्यायाम शायद सबसे शारीरिक चोट विधि है, एक विशेष मांसपेशियों को चोट केवल सीमितहै 20. फ्रीज चोटों लागू किया जा सकता है जब चोट की साइट की ओर उपग्रह कोशिकाओं के प्रवास के अध्ययन का उद्देश्य है या मांसपेशियों का केवल एक विशिष्ट हिस्सा घायल होना चाहिए. प्रायोगिक रूप से फ्रीज चोटों का नुकसान खुली सर्जरी है जो precooled धातु जांच लागू करने के लिए किया जाना चाहिए है। BaCl2 या सांप के जहर का इंजेक्शन चोट का सबसे नाटकीय तरीका है, जिससे उपग्रह सेल समारोह को चुनौती देने के सबसे अधिक है. इसके अलावा, इंजेक्शन न्यूनतम इनवेसिव है, सर्जरी समय, सामान्य रूप में, कम से कम पांच मिनट है और suturing शामिल नहीं है, आदि जिससे संक्रमण के जोखिम को कम से कम.
मांसपेशियों की चोट का उपयोग ज्यादातर जीन कार्यों के नुकसान के कार्यात्मक परिणामों की जांच करने के लिए किया जाता है, उदा, पैक्स77,21की हानि । खासकर अगर वृद्ध चूहों वैज्ञानिक सवाल का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, पीढ़ी या ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग अक्सर संभव नहीं है. एक विशिष्ट जीन को लक्षित स्वयं वितरण siRNAs का इंजेक्शन उन मामलों में एक व्यवहार्य विकल्प है और सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है22. संक्षेप में, चूहों की tibialis पूर्वकाल मांसपेशी कार्डियोटॉक्सिन और स्वयं देने siRNAs के इंजेक्शन से घायल हो गया था फाइब्रोनेक्टिन के खिलाफ निर्देशित (FN) चोट के बाद दिन 3 में इंजेक्शन थे. मांसपेशियों का विश्लेषण किया गया 10 दिन चोट के बाद और उपग्रह सेल संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी siFN बनाम तले हुए siRNA नियंत्रण की स्थिति में मनाया गया. नॉकडाउन दक्षता मात्रात्मक रियल टाइम पीसीआर द्वारा पूरे मांसपेशी lysates में निर्धारित किया गया था 2 दिन siRNA इंजेक्शन के बाद, 58% की अभिव्यक्ति के स्तर में कमी का सुझाव है कि वितरण और knockdown दक्षता कार्यात्मक के लिए पर्याप्त हैं प्राप्त किया गया था विश्लेषण22| नॉकडाउन दक्षता के परीक्षण के लिए विकल्प या तो इम्यूनोब्लॉट या इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण कर रहे हैं, जिसमें लक्ष्य जीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ। दक्षता और सिआरएनए के लिए इस्तेमाल किया vivo इंजेक्शन में के लिए इस्तेमाल किया चूहों में इंजेक्शन से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, अलग उपग्रह कोशिकाओं या प्राथमिक मायोब्लास्ट में दक्षता का परीक्षण करके. एक एकल siRNA बनाम 4 अलग siRNAs से मिलकर एक स्मार्ट पूल का उपयोग knockdown की दक्षता बढ़ जाती है, लेकिन यह भी unspecific लक्ष्यीकरण का खतरा बढ़ जाता है. सभी siRNA दृश्यों की विशिष्टता सेल संस्कृति में परीक्षण किया जाना चाहिए बंद लक्ष्य प्रभाव से बचने के लिए. एक नियंत्रण के रूप में, एक गैर-लक्ष्यतले siRNA उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि से प्रति एक siRNA के इंजेक्शन इंजेक्शन के कारण पुनर्जनन प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है और, इस तरह, मांसपेशियों की अतिरिक्त क्षति. SiRNA इंजेक्शन का समय बिंदु वैज्ञानिक सवाल पर और लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पर निर्भर करता है. आम तौर पर, कार्डियोटॉक्सिन चोट के बाद दिन 3 में आत्म-वितरण siRNA का एक इंजेक्शन चोट के बाद 3 दिन के आसपास उपग्रह सेल प्रसार चोटियों के बाद उपग्रह सेल प्रसार के लिए महत्वपूर्ण सबसे जीन लक्ष्य। पहले सिराना इंजेक्शन के लिए समय बिंदु कार्डियोटॉक्सिन चोट के बाद कम से कम 48 एच नहीं होना चाहिए क्योंकि कार्डियोटॉक्सिन की इंजेक्शन मात्रा काफी अधिक है और मांसपेशियों में अतिरिक्त समाधान इंजेक्शन लगाने से पहले तरल का पुन: अवशोषण होना चाहिए। सामान्य में, siRNAs या विभिन्न siRNAs का एक संयोजन के कई इंजेक्शन संभव है, हालांकि एक पर विचार करना चाहिए कि regenerating मांसपेशियों में प्रत्येक इंजेक्शन अतिरिक्त नुकसान पैदा कर रहा है.
वर्णित विधि की एक सीमा तथ्य यह है, कि प्रभाव मनाया जरूरी केवल उपग्रह कोशिकाओं में लक्ष्य जीन के knockdown के आधार पर नहीं है, लेकिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं या फाइब्रो-एडिपजेनिक जनक कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. इसलिए, यह उपग्रह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी की जांच प्रयोगों के साथ उन प्रयोगों गठबंधन करने के लिए आवश्यक है. एक या तो अस्थायी मायोफाइबर संस्कृतियों का उपयोग करके प्रयोग कर सकता है, जहां उपग्रह कोशिकाओं को उनके आसन्न मायोफाइबर पर सुसंस्कृत किया जाता है या अलग उपग्रह कोशिकाओं का उपयोग करके प्रत्यारोपण प्रयोग कर सकतेहैं।
स्वयं देने siRNAs के इंजेक्शन के लिए एक विकल्प छोटे अणु inhibitors या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन जो प्रदर्शन किया जा सकता है, वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर इंजेक्शन है. उदाहरण के लिए, अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन या JAK/STAT संकेतन के छोटे अणु अवरोधकों का इंजेक्शन सफलतापूर्वक आयु वर्ग के चूहों में किया गया है15,16. कंकाल की मांसपेशी के पुनर्जनन के दौरान एक विशिष्ट कोशिका प्रकार में एक विशेष जीन समारोह का विश्लेषण, उदा., उपग्रह कोशिकाओं में, एक induible आनुवंशिक माउस मॉडल के उपयोग के माध्यम से ही संभव है. आत्म वितरण siRNAs के इंजेक्शन, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन या छोटे अणु inhibitors regenerating कंकाल की मांसपेशी में कई सेल प्रकार को प्रभावित कर सकता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.
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Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
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Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
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Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
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M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |