Nous décrivons une méthode in vivo pour étudier la perte fonctionnelle d’un gène spécifique dans les cellules satellites en utilisant une combinaison de la blessure médiée par cardiotoxine du muscle squelettique et l’injection d’un siRNA auto-livrant.
Le muscle squelettique possède une énorme capacité à se régénérer après une blessure. Ce processus est principalement piloté par des cellules souches musculaires, également appelées cellules satellites. Les cellules satellites sont caractérisées par l’expression du facteur de transcription Pax7 et leur emplacement sous la lame basale dans le muscle squelettique au repos. Lors d’une blessure, les cellules satellites s’activent, subissent un auto-renouvellement ou une différenciation pour former de nouvelles myofibres ou fusionner avec des cellules endommagées. La fonctionnalité des cellules satellites in vivo peut être étudiée à l’aide d’un modèle de blessure à base de cardiotoxine du muscle squelettique. Pour étudier la fonction d’un gène pendant la régénération du muscle squelettique, des modèles de souris transgéniques sont principalement utilisés. Ici, nous présentons une méthode alternative aux souris transgéniques, pour étudier la fonction génique dans les cellules satellites pendant la régénération, par exemple, dans les cas où les souris transgéniques ne sont pas disponibles. Nous combinons la blessure médiée par cardiotoxine d’un muscle squelettique spécifique avec l’injection d’un siRNA auto-livrant dans le muscle régénérant qui est alors pris par des cellules satellites parmi d’autres cellules. Par conséquent, nous fournissons une méthode pour analyser la fonction génique dans les cellules satellites pendant la régénération dans des conditions physiologiques sans avoir besoin de souris transgéniques.
Le muscle squelettique est le plus grand tissu du corps représentant environ 40% du poids total du corps permettant la locomotion volontaire. L’architecture tissulaire du muscle squelettique est principalement composée de myofibres postmitotiques, terminalement différenciées, multinucléées ainsi que de diverses autres cellules du système nerveux périphérique, du système vasculaire et des cellules interstitiels1. Fait important, le muscle squelettique a une capacité énorme de régénérer et de restaurer la fonction sur les blessures ou les dommages2. Ce processus dépend des cellules souches musculaires résidentes de tissu également appelées cellules satellites3,4. Les cellules satellites sont situées entre la myofibre et la lame basale et caractérisées par l’expression du facteur de transcription Pax75,6,7. Dans des conditions homéostatiques, les cellules satellites sont calmes mais s’activent en raison de blessures traumatiques, par exemple, par l’exercice excentrique ou expérimentalement par injection de la cardiotoxine de venin de serpent6,8. Une fois activées, les cellules satellites positives Pax7 co-expriment MyoD et Myf5, qui engage les cellules souches à la différenciation myogénique. Les cellules satellites qui résistent à l’upregulation des facteurs d’engagement conserveront leur potentiel de tige et reviendront à la quiétude pour reconstituer le pool de cellules souches pour les demandes futures. Après l’expansion du pool d’ancêtres myogéniques, les réseaux transcriptionnels sont activés par des facteurs de différenciation comme la myogénine pour initier la sortie du cycle cellulaire et la différenciation terminale. Ces myogènes fusionnent ensuite les uns aux autres ou aux myofibres existantes contribuant myonuclei pour maintenir la taille du domaine myonucléaire. Les myofibers expriment des gènes de différenciation musculaire terminale comme Myosin Heavy Chain. Enfin, les myofibres nouvellement formées se développent et mûrissent pour construire les unités fonctionnelles du muscle squelettique9,10.
La régénération du muscle squelettique peut être affectée par diverses conditions comprenant des maladies de muscle ou vieillissement11,12,s’étendant des affaiblissements doux aux conditions représentant un danger pour la vie, par exemple, dans la dystrophie musculaire de Duchenne13 , 14. Par conséquent, la médecine régénérative vise à restaurer les tissus musculaires squelettiques endommagés ou défectueux en utilisant sa puissance régénératrice inhérente en ciblant la fonction cellulaire satellite15,16. Pour utiliser son plein potentiel, une compréhension complète des cellules satellites dans leur niche endogène lors de la régénération du muscle squelettique est nécessaire. Bien qu’il existe des approches expérimentales pour isoler les cellules satellites adjacentes à leurs myofibres17, la complexité complète des interactions cellulaires et systémiques des cellules satellites avec leur environnement ne peut être récapitulée qu’in vivo. À cet égard, une grande connaissance de la régénération des muscles squelettiques a été acquise à l’aide de modèles de blessures de souris2,18.
Ici nous introduisons un modèle expérimental spécifique de blessure de souris pour étudier la régénération médiée de cellules souches des dommages cardiotoxine-induits du muscle antérieur de tibialis in vivo. La cardiotoxine, une toxine cytolytique dérivée du serpent qui provoque la dépolarisation et la nécrose myofibres, est injectée dans le muscle antérieur de la tibialis, qui à son tour déclenchera la dégénérescence tissulaire suivie de la régénération. Pour analyser la fonction des gènes pendant la régénération aigue, les siARN auto-livrants sont injectés au jour 3 après la blessure, au plus fort de l’expansion des cellules satellites. Les animaux expérimentaux sont sacrifiés à divers moments et les muscles antérieurs de tibialis sont rassemblés. Les muscles disséqués sont congelés et traités pour une cryo-sectionnement ultérieur. La microscopie d’immunofluorescence est alors employée pour analyser des marqueurs de régénération. Cette méthode permet d’enquêter sur la fonction d’un seul gène pendant la régénération par cellule satellite du muscle squelettique à l’aide de souris de type sauvage.
Ici nous présentons une méthode pour étudier la fonction d’un gène spécifique pendant la régénération du muscle squelettique sans avoir besoin des animaux transgéniques. Ceci est accompli par la combinaison de la cardiotoxine induite des dommages de muscle avec l’injection d’un siRNA auto-livrant dans le muscle squelettique régénérant au jour 3 après blessure. Nous avons décrit en détail les procédures des dommages de muscle par cardiotoxine, l’injection du siRNA d’auto-livraison et le traitement des muscles moissonnés pour analyser les progrès de la régénération. Nous démontrons que l’injection de la cardiotoxine de venin de serpent dans le muscle squelettique blesse effectivement le muscle entier et que les siARN auto-livrants sont trouvés dans environ 75% de toutes les cellules satellites parmi d’autres types de cellules deux jours après leur injection dans le régénérer le muscle squelettique (Figure 4, Figure 5).
Une attention particulière devrait être concentrée sur une blessure homogène du muscle antérieur de tibialis puisque des degrés variables de blessure influencent le résultat de régénération et ainsi également l’effet du siRNA pourrait être affecté. En outre, il est d’une importance cruciale que toute la zone de régénération soit injectée avec le siRNA auto-livrant. Pour l’analyse du processus de régénération, il est recommandé de toujours comparer des zones similaires du muscle squelettique régénérateur, par conséquent, le muscle antérieur tibialis doit être coupé en deux pour toujours comparer la région du ventre moyen du muscle. Lors de l’analyse du muscle, toute la cryosection doit être analysée puisque la composition de myofiber diffère dans le muscle antérieur de tibialis et pourrait donc se régénérer différemment.
La fonction des cellules satellites peut être étudiée par diverses procédures expérimentales, y compris leur culture sur les myofibers isolées adjacentes17, par transplantation et en analysant la régénération du muscle squelettique après des blessures induites 18,19. L’étude de la fonction des cellules satellitaires à l’aide d’un modèle de lésions induites in vivo, par exemple, l’injection de cardiotoxine, permet d’analyser la fonction des cellules satellitaires également en termes d’interaction avec d’autres types de cellules tels que les macrophages et l’influence des facteurs systémiques2. Les blessures du muscle squelettique peuvent être accomplies par divers moyens, par exemple, exercice excentrique, blessure de gel, injection de BaCl2 ou injection de venins de serpent tels que la cardiotoxine ou la notexine18. Alors que l’exercice excentrique est probablement la méthode de blessure la plus physiologique, la blessure à un muscle particulier est seulement limitée20. Les blessures par gel peuvent être appliquées lorsque la migration des cellules satellites vers le site de la blessure est le but de l’étude ou que seule une partie spécifique du muscle doit être blessée. Expérimentalement, l’inconvénient des blessures de gel est la chirurgie ouverte qui doit être effectuée pour appliquer la sonde métallique prérefroidie. L’injection de veins De BaCl2 ou de serpent est la méthode de blessure la plus spectaculaire, ce qui remet le plus en question la fonction des cellules satellites. En outre, l’injection est peu invasive, le temps de chirurgie, en général, est de moins de cinq minutes et ne comporte pas de suture, etc. minimisant ainsi le risque d’infections.
Les lésions musculaires sont principalement utilisées pour étudier les conséquences fonctionnelles de la perte des fonctions génétiques, par exemple, la perte de Pax77,21. Surtout si les souris âgées sont au centre de la question scientifique, la génération ou l’utilisation de souris transgéniques n’est souvent pas faisable. L’injection de siARN auto-livrants ciblant un gène spécifique est une alternative viable dans ces cas et a été utilisée avec succès22. En bref, le muscle antérieur de tibialis des souris a été blessé par injection de cardiotoxine et les siRNAs auto-livrants dirigés contre la fibronectin (FN) ont été injectés au jour 3 après des dommages. Les muscles ont été analysés 10 jours après des dommages et une diminution significative des nombres de cellules de satellite a été observée dans les conditions de commande de siFN contre brouillées de siRNA. L’efficacité de knockdown a été déterminée dans les lysates entiers de muscle par PCR en temps réel quantitatif 2 jours après injection de siRNA, une réduction des niveaux d’expression de 58% a été réalisé suggérant que la livraison et l’efficacité de knockdown sont suffisantes pour fonctionnel analyses22. Les solutions de rechange pour tester l’efficacité de knockdown sont des analyses immunoblot ou immunofluorescence avec des anticorps dirigés contre le gène cible. L’efficacité et la spécificité du siRNA utilisé pour les injections in vivo doivent être déterminées avant l’injection chez la souris, par exemple en testant l’efficacité dans des cellules satellites isolées ou des myoblastes primaires. L’utilisation d’un pool intelligent composé de 4 siRNAs différents par rapport à un seul siRNA augmente l’efficacité de knockdown mais augmente également le risque de ciblage non spécifique. La spécificité de toutes les séquences de siRNA utilisées doit être testée dans la culture cellulaire afin d’éviter les effets hors cible. Comme un contrôle, un siRNA brouillé non-ciblage devrait être utilisé puisque l’injection d’un siRNA en soi pourrait influencer le processus de régénération due à l’injection et, par conséquent, des dommages supplémentaires du muscle. Le moment d’injection du siRNA dépend de la question scientifique et du profil d’expression du gène cible. En général, une injection de siRNA auto-livrant au jour 3 après des dommages de cardiotoxine cible la plupart des gènes importants pour la prolifération de cellules satellites puisque la prolifération de cellules satellites culmine autour du jour 3 après des dommages. Le délai pour la première injection de siRNA ne devrait pas être inférieur à 48 h après une blessure cardiotoxine puisque le volume d’injection de cardiotoxine est assez élevé et la réabsorption du liquide aurait dû avoir lieu avant d’injecter des solutions supplémentaires dans le muscle. En général, des injections multiples de siARN ou une combinaison de différents siRNAs est possible, bien qu’il faut considérer que chaque injection dans le muscle régénérateur cause des dommages supplémentaires.
Une limitation de la méthode décrite est le fait, que l’effet observé n’est pas nécessairement seulement en fonction de l’élimination du gène cible dans les cellules satellites, mais pourrait être attribuée à d’autres types de cellules telles que les cellules immunitaires ou les cellules progénitrices fibro-adipogenic. Par conséquent, il est nécessaire de combiner ces expériences avec des expériences sur une population pure de cellules satellites. On peut soit effectuer des expériences à l’aide de cultures de myofibre flottantes, où les cellules satellites sont cultivées sur leurs myofibres adjacentes ou effectuer des expériences de transplantation à l’aide de cellules satellites isolées17.
Une alternative à l’injection de siARN auto-livrants est l’injection d’inhibiteurs de petites molécules ou de protéines recombinantes qui peuvent être effectuées, selon la question scientifique. Par exemple, l’injection de la fibronectine extracellulaire de protéine de matrice ou des inhibiteurs de petite molécule de la signalisation de JAK/STAT ont été avec succès exécutées chez les souris âgées15,16. L’analyse d’une fonction génétique particulière dans un type de cellule spécifique lors de la régénération du muscle squelettique, par exemple, dans les cellules satellites, n’est possible que par l’utilisation d’un modèle de souris génétique inductible. Les injections de siARN auto-livrants, de protéines recombinantes ou d’inhibiteurs de petites molécules peuvent affecter plusieurs types de cellules dans la régénération du muscle squelettique.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |