We beschrijven een in vivo methode om het functionele verlies van een specifiek gen in satelliet cellen te onderzoeken met behulp van een combinatie van cardiotoxine gemedieerde verwonding van de skeletspieren en de injectie van een zelfvoorzienend siRNA.
Skeletspieren bezit een enorme capaciteit om te regenereren na letsel. Dit proces wordt voornamelijk gedreven door spier stamcellen, ook wel satelliet cellen genoemd. Satelliet cellen worden gekenmerkt door de uitdrukking van de transcriptiefactor Pax7 en hun locatie onder de basale lamina in de rust skeletspieren. Bij letsel worden de satelliet cellen geactiveerd, ondergaan ze zelf vernieuwing of differentiëren om nieuwe myovezels te vormen of om te smelten met beschadigde. De functionaliteit van de satelliet cellen in vivo kan worden onderzocht met behulp van een cardiotoxine gebaseerd letsel model van skeletspieren. Om de functie van één gen tijdens de regeneratie van de skeletspieren te bestuderen, worden transgene muismodellen meestal gebruikt. Hier presenteren we een alternatieve methode voor transgene muizen, om de genfunctie in satelliet cellen tijdens regeneratie te onderzoeken, bijvoorbeeld in gevallen waarin geen transgene muizen beschikbaar zijn. We combineren de cardiotoxine gemedieerde verwonding van een specifieke skeletspier met de injectie van een self-leveren siRNA in de regeneratie spier die vervolgens wordt overgenomen door satelliet cellen onder andere cellen. Daardoor bieden we een methode om de genfunctie in satelliet cellen te analyseren tijdens regeneratie onder fysiologische omstandigheden zonder de noodzaak van transgene muizen.
Skeletspieren is het grootste weefsel van het lichaam dat ongeveer 40% van het totale lichaamsgewicht vertegenwoordigt, waardoor vrijwillige motoriek mogelijk is. De weefsel architectuur van de skeletspieren bestaat voornamelijk uit postmitotische, terminaal gedifferentieerde, meerkernige myovezels en verschillende andere cellen uit het perifere zenuwstelsel, het vasculaire systeem en de interstitiële cellen1. Belangrijk, skeletspieren heeft een enorme capaciteit om te regenereren en herstellen van de functie op letsel of schade2. Dit proces is afhankelijk van de weefsel Resident spier stamcellen ook wel satelliet cellen3,4. Satelliet cellen bevinden zich tussen de myofiber en de basale lamina en worden gekenmerkt door de uitdrukking van de transcriptiefactor Pax75,6,7. Onder homeostatische omstandigheden, satelliet cellen zijn stilaan, maar worden geactiveerd als gevolg van traumatisch letsel, bijvoorbeeld door excentrieke oefening of experimenteel door middel van injectie van de slang Venom cardiotoxin6,8. Eenmaal geactiveerd, Pax7 positieve satelliet cellen Co-express MyoD en Myf5, die de stamcellen tot myogenic differentiatie verbindt. Satelliet cellen die weerstaan aan de opregulatie van commitment factoren zullen hun stemlijkheid potentieel behouden en terugkeren naar onbeweeglijkheid om de stamcel pool aan te vullen voor toekomstige eisen. Na de uitbreiding van de myogene voorlopercellen pool worden transcriptionele netwerken geactiveerd door differentiatie factoren zoals Myogenin om de celcyclus uitgang en terminale differentiatie te initiëren. Deze myoprogenitoren smelten vervolgens met elkaar of met bestaande myofibers die myonuclei bij zich dragen om de grootte van het myonuclear domein te behouden. De myofibers Express terminale spier differentiatie genen zoals myosin Heavy chain. Tot slot, de nieuw gevormde myofibers groeien en volwassen te bouwen van de functionele eenheden van skeletspieren9,10.
De regeneratie van de skeletspieren kan worden beïnvloed door verschillende aandoeningen, waaronder spierziekten of veroudering11,12, variërend van milde beperkingen tot levensbedreigende omstandigheden, bijvoorbeeld in Duchenne spierdystrofie13 , 14. Daarom, regeneratieve geneeskunde is bedoeld om te herstellen van beschadigde of slecht functionerende skeletspieren weefsel met behulp van de inherente regeneratieve kracht door targeting satelliet Cell functie15,16. Om zijn volledige potentieel te gebruiken een uitgebreid begrip van de satelliet cellen in hun endogene niche tijdens de regeneratie van de skeletspieren is vereist. Hoewel experimentele benaderingen bestaan voor het isoleren van satelliet cellen grenzend aan hun myofibers17, kan de volledige complexiteit van cellulaire en systemische interacties van satelliet cellen met hun omgeving alleen in vivo worden geherculeerd. In dat opzicht is grote kennis over de regeneratie van skeletspieren verworven met behulp van muis blessure modellen2,18.
Hier introduceren we een specifiek experimenteel muis blessure model om de stamcel gemedieerde regeneratie van cardiotoxine-geïnduceerde schade van het tibialis anterieure spier in vivo te bestuderen. Cardiotoxine, een slang afgeleid cytolytische toxine die myofiber depolarisatie en necrose veroorzaakt, wordt geïnjecteerd in het tibialis anterieure spier, die op zijn beurt zal leiden tot weefsel degeneratie gevolgd door regeneratie. Om de functie van genen tijdens acute regeneratie te analyseren, worden zelfvoorzienende Sirna’s geïnjecteerd op dag 3 na letsel, op het hoogtepunt van de uitbreiding van de satelliet cellen. Proefdieren worden geofferd op verschillende tijdstippen en de tibialis anterieure spieren worden opgevangen. De ontleed spieren worden bevroren en verwerkt voor verdere Cryo-sectioning. Immunofluorescentie microscopie wordt vervolgens gebruikt om markers voor regeneratie te analyseren. Deze methode maakt het mogelijk om de functie van een enkel gen te onderzoeken tijdens de regeneratie van de skeletspieren door een satelliet cel met behulp van wild type muizen.
Hier presenteren we een methode om de functie van een specifiek gen te onderzoeken tijdens de regeneratie van de skeletspieren zonder de noodzaak van transgene dieren. Dit wordt bereikt door de combinatie van cardiotoxine geïnduceerde spierblessure met de injectie van een self-leveren siRNA in de regenererende skeletspieren op dag 3 na letsel. We hebben beschreven in detail de procedures van spier letsel door cardiotoxine, de injectie van de Self-leveren siRNA en de verwerking van de geoogste spieren om de voortgang van de regeneratie te analyseren. We tonen aan dat injectie van het slangen gif cardiotoxine in skeletspieren de hele spier effectief verwont en dat zelfvoorzienende Sirna’s in ongeveer 75% van alle satelliet cellen onder andere celtypen worden aangetroffen twee dagen na hun injectie in de regeneratie van de skeletspieren (Figuur 4, Figuur 5).
Bijzondere aandacht moet worden besteed aan een homogene verwonding van de anterieure spier van tibialis, aangezien verschillende gradaties van letsel de regeneratie uitkomst beïnvloeden en daardoor ook het effect van de siRNA kan worden aangetast. Bovendien is het van cruciaal belang dat het hele regenererende gebied wordt geïnjecteerd met de zelfstellende siRNA. Voor de analyse van het regeneratieproces, is het raadzaam om altijd vergelijkbare gebieden van de regenererende skeletspieren, daarom, de tibialis anterieure spier moet worden gehalveerd om altijd het midden van de buik regio van de spier te vergelijken. Bij het analyseren van de spier, de hele cryosectie moet worden geanalyseerd omdat myofiber samenstelling verschilt in de tibialis anterieure spier en kan daarom regenereren anders.
De functie van satelliet cellen kan worden onderzocht door verschillende experimentele procedures, met inbegrip van hun cultuur op de aangrenzende geïsoleerde enkelvoudige myovezels17, door transplantatie en door het analyseren van de regeneratie van de skeletspieren na geïnduceerde letsel 18,19. Het onderzoeken van de functie van satelliet cellen met behulp van een in vivo geïnduceerde letsel model, bijvoorbeeld, injectie van cardiotoxine, biedt de mogelijkheid om te analyseren van de functie van de satelliet-cel ook in termen van hun interactie met andere celtypen zoals macrofagen en onderzoek naar de invloed van systemische factoren2. Letsel van de skeletspieren kan worden bereikt met verschillende middelen, bijvoorbeeld, excentrische oefening, bevriezing letsel, injectie van BaCl2 of injectie van slangen vergiften zoals cardiotoxine of notexin18. Hoewel excentrische oefening waarschijnlijk de meest fysiologische blessure methode is, is de verwonding aan een bepaalde spier slechts beperkt tot20. Bevriezing verwondingen kunnen worden toegepast wanneer de migratie van satelliet cellen naar de plaats van letsel is het doel van de studie of slechts een specifiek deel van de spier moet worden gewond. Experimenteel het nadeel van bevriezings blessures is de open chirurgie die moet worden uitgevoerd om de gekoelde metaal sonde toe te passen. Injectie van BaCl2 of slangen vergiften is de meest dramatische methode van letsel, waardoor uitdagende satellietcel functie het meest. Bovendien, de injectie is minimaal invasief, chirurgie tijd, in het algemeen, is minder dan vijf minuten en geen betrekking hebben op het suturing, etc. waardoor het risico van infecties te minimaliseren.
Spier letsel wordt meestal gebruikt om de functionele gevolgen van verlies van genfuncties te onderzoeken, bijvoorbeeld verlies van Pax77,21. Vooral als leeftijd muizen de focus van de wetenschappelijke vraag zijn, is de generatie of het gebruik van transgene muizen vaak niet haalbaar. Injectie van zelfvoorzienende Sirna’s gericht op een specifiek gen is in die gevallen een levensvatbaar alternatief en is met succes22gebruikt. In het kort, de tibialis anterieure spier van muizen werd gewond door injectie van cardiotoxine en zelfvoorzienende Sirna’s gericht tegen fibronectin (FN) werden geïnjecteerd op dag 3 na letsel. De spieren werden 10 dagen na het letsel geanalyseerd en er werd een significante afname van de satelliet cellen waargenomen in siFN versus roerdende siRNA-controle omstandigheden. De daling van de efficiëntie werd bepaald in hele spier lysaten door kwantitatieve real-time PCR 2 dagen na de injectie met siRNA, een afname van de uitdrukkings niveaus van 58% werd bereikt, wat suggereert dat de lever-en afdek efficiëntie voldoende zijn voor functionele analyses22. Alternatieven voor het testen van de knockdown-efficiëntie zijn immunoblot-of immunofluorescentie analyses met antilichamen tegen het doel gen. De efficiëntie en specificiteit van de siRNA gebruikt voor in vivo injecties moet worden bepaald vóór de injectie in muizen, bijvoorbeeld door het testen van de efficiëntie in geïsoleerde satelliet cellen of primaire myoblasten. Het gebruik van een Smart pool bestaande uit 4 verschillende Sirna’s versus een enkele siRNA verhoogt de efficiëntie van knockdown, maar verhoogt ook het risico van niet-specifieke targeting. De specificiteit van alle gebruikte siRNA-sequenties moet worden getest in celkweek om niet-doel effecten te voorkomen. Als een controle, moet een niet-gerichte versleutelde siRNA worden gebruikt, aangezien de injectie van een siRNA per se het regeneratieproces kan beïnvloeden als gevolg van de injectie en daardoor extra schade aan de spier. Het tijdpunt van het injecteren van de siRNA is afhankelijk van de wetenschappelijke vraag en het uitdrukkings Profiel van het doel gen. In het algemeen, een injectie van Self-leveren siRNA op dag 3 na cardiotoxine letsel richt zich op de meeste genen belangrijk voor de proliferatie van de satelliet cellen sinds de satelliet celproliferatie pieken rond dag 3 na letsel. Het tijdstip voor de eerste injectie met siRNA mag niet minder zijn dan 48 h na cardiotoxine letsel omdat het injectievolume van cardiotoxine vrij hoog is en reabsorptie van de vloeistof moet plaatsvinden voordat aanvullende oplossingen in de spier worden geïnjecteerd. Over het algemeen zijn meerdere injecties van Sirna’s of een combinatie van verschillende Sirna’s mogelijk, hoewel men moet bedenken dat elke injectie in de regeneratie spier extra schade veroorzaakt.
Een beperking van de beschreven methode is het feit, dat het waargenomen effect niet noodzakelijkerwijs alleen afhankelijk is van de knockdown van het doel-gen in satelliet cellen, maar kan worden toegeschreven aan andere celtypen zoals immuuncellen of Fibro-adipogene voorlopercellen. Daarom is het noodzakelijk om die experimenten te combineren met experimenten die een zuivere populatie van satelliet cellen onderzoeken. Men kan ofwel experimenten uitvoeren met behulp van zwevende myovezel culturen, waarbij satelliet cellen worden gekweekt op hun aangrenzende myofibers of transplantatie experimenten uitvoeren met geïsoleerde satelliet cellen17.
Een alternatief voor de injectie van zelfvoorzienende Sirna’s is de injectie van kleine molecuul remmers of recombinante eiwitten die kunnen worden uitgevoerd, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag. Zo is de injectie van de extracellulaire matrix proteïne fibronectin of kleine molecuul remmers van Jak/Stat-signalering met succes uitgevoerd bij oudere muizen15,16. De analyse van een bepaalde genfunctie in een specifiek celtype tijdens de regeneratie van de skeletspieren, bijvoorbeeld in satelliet cellen, is alleen mogelijk door het gebruik van een induceerbaar genetisch muismodel. Injecties van Self-leveren Sirna’s, recombinant eiwitten of kleine molecuul remmers kunnen invloed hebben op meerdere celtypen in het regenereren van skeletspieren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |