Vi beskriver en in vivo metod för att undersöka funktionell förlust av en specifik gen i satellit celler genom att använda en kombination av kardiotoxin medierad skada av skelettmuskulaturen och injektion av en självförsörjande siRNA.
Skelettmuskulaturen besitter en enorm förmåga att regenerera efter skada. Denna process drivs främst av muskelstamceller, även kallade satellit celler. Satellit celler kännetecknas av uttrycket av transkriptionsfaktorn Pax7 och deras placering under den basala lamina i vila skelettmuskulaturen. Vid skada, satellit celler få aktiveras, genomgå självförnyelse eller differentiering till antingen bilda nya myofibers eller att smälta med skadade sådana. Funktionaliteten hos satellit celler in vivo kan undersökas med hjälp av en kardiotoxin baserad skada modell av skelettmuskulaturen. För att studera funktionen av en gen under regenerering av skelettmuskulaturen, transgena möss modeller används oftast. Här presenterar vi en alternativ metod för att transgena möss, att undersöka gen funktionen i satellit celler under förnyelse, t. ex., i fall där transgena möss inte är tillgängliga. Vi kombinerar kardiotoxin medierad skada av en specifik skelettmuskulaturen med injektion av en själv-leverera siRNA i regenererande muskler som sedan tas upp av satellit celler bland andra celler. Därmed, vi ger en metod för att analysera genfunktion i satellit celler under föryngring under fysiologiska förhållanden utan behov av transgena möss.
Skelettmuskulaturen är kroppens största vävnad som representerar cirka 40% av den totala kroppsvikten möjliggör frivillig förflyttning. Vävnads arkitekturen i skelettmuskulaturen består huvudsakligen av postmitotiska, terminalt differentierade, multinukleerade myofibers samt olika andra celler från det perifera nervsystemet, vaskulära systemet, och interstitiella celler1. Viktigt, skelettmuskulaturen har en enorm förmåga att regenerera och återställa funktionen vid skada eller skada2. Denna process beror på vävnad bosatta muskelstamceller också kallas satellit celler3,4. Satellit celler är placerade mellan myofiber och basal lamina och kännetecknas av uttrycket av transkriptionsfaktorn Pax75,6,7. Under homeostatiska förhållanden, satellit celler är quiescent men få aktiveras på grund av traumatisk skada, e.g., genom excentrisk övning eller experimentellt genom injektion av ormen Venom cardiotoxin6,8. När aktiverad, Pax7 positiva satellit celler Co-Express MyoD och Myf5, som begår stamceller till Myogenic differentiering. Satellit celler som motsätter sig uppreglering av engagemang faktorer kommer att behålla sin stemness potential och återgå till vilo att fylla på stamcells bassängen för framtida krav. Efter utbyggnaden av Myogenic stamcells bassängen, transkriptionella nätverk aktiveras genom differentiering faktorer som Myogenin att initiera cellcykeln exit och Terminal differentiering. Dessa myoprogenitors sedan säkring till varandra eller till befintliga myofibers bidragande myonuklei att bibehålla storleken på myonukleära domänen. Den myofibers Express Terminal muskel differentiering gener som myosin tung kedja. Slutligen, den nybildade myofibers växa och mogna för att bygga de funktionella enheter av skelettmuskulaturen9,10.
Regenerering av skelettmuskulaturen kan påverkas av olika förhållanden, inklusive muskelsjukdomar eller åldrande11,12, allt från milda nedskrivningar till livshotande tillstånd, e.g., i Duchennes muskeldystrofi13 , 14. regenerativ medicin syftar därför till att återställa skadad eller funktionsstörning skelettmuskelvävnad med hjälp av dess inneboende regenerativ effekt genom att rikta satellit cells funktion15,16. Att använda sin fulla potential en omfattande förståelse av satellit celler i deras endogena nisch under regenerering av skelettmuskulaturen krävs. Även experimentella metoder finns för att isolera satellit celler i anslutning till deras myofibers17, den fulla komplexiteten av cellulära och systemiska interaktioner av satellit celler med sin omgivning kan endast återfått in vivo. I detta avseende har stor kunskap om skelettmuskel förnyelse förvärvats med hjälp av mus skada modeller2,18.
Här introducerar vi en specifik experimentell mus skademodell för att studera stamcells-medierad förnyelse av kardiotoxin-inducerad skada av tibialis främre muskel in vivo. Cardiotoxin, en orm som härrör cytolytiskt toxin som orsakar myofiber depolarisering och nekros, injiceras i tibialis främre muskeln, som i sin tur kommer att utlösa vävnads degeneration följt av förnyelse. För att analysera geners funktion vid akut förnyelse injiceras självförsörjande siRNAs vid dag 3 efter skada, vid toppen av satelliten cell expansion. Försöksdjur offras vid olika tidpunkter och tibialis främre muskler samlas in. De dissekerade musklerna fryses och bearbetas för ytterligare kryo-snittning. Immunofluorescensmikroskopi används sedan för att analysera regenereringsmarkörer. Denna metod möjliggör utredning av funktionen av en enda gen under satellit cell driven förnyelse av skelettmuskulaturen med hjälp av vild typ möss.
Här presenterar vi en metod för att undersöka funktionen hos en specifik gen under regenerering av skelettmuskulaturen utan behov av transgena djur. Detta åstadkoms genom kombinationen av kardiotoxin inducerad muskel skada med injektion av en självförsörjande siRNA i regenererande skelettmuskulaturen på dag 3 efter skada. Vi har beskrivit i detalj förfarandena för muskel skada av cardiotoxin, injektion av den självförsörjande siRNA och bearbetning av de skördade musklerna att analysera utvecklingen av förnyelse. Vi visar att injektion av ormen Venom cardiotoxin i skelettmuskulaturen effektivt skadar hela muskeln och att självförsörjande siRNAs finns i cirka 75% av alla satellit celler bland andra celltyper två dagar efter deras injektion i skelettmuskulaturen (figur 4, figur 5).
Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt en homogen skada av tibialis främre muskel eftersom varierande grad av skada påverkar regenereringsresultatet och därmed även effekten av siRNA kan påverkas. Dessutom är det ytterst viktigt att hela regenererande området injiceras med själv leverans ande siRNA. För analys av regenereringsprocessen, det rekommenderas att alltid jämföra liknande områden av regenererande skelettmuskulaturen, därför bör tibialis främre muskeln skäras i hälften för att alltid jämföra mitten av magen regionen av muskeln. Vid analys av muskeln, hela kryosektionen måste analyseras eftersom myofiber sammansättningen skiljer sig i tibialis främre muskeln och kan därför regenerera annorlunda.
Funktionen av satellit celler kan undersökas genom olika experimentella förfaranden inklusive deras kultur på angränsande isolerade enda myofibers17, genom transplantation och genom att analysera förnyelse av skelettmuskulaturen efter inducerad skada 18,19. Undersöka funktionen av satellit celler med hjälp av en in vivo inducerad skada modell, t. ex., injektion av cardiotoxin, ger möjlighet att analysera satellit cell funktion även när det gäller deras interaktion med andra celltyper såsom makrofager och utredning av påverkan av systemiska faktorer2. Skada av skelettmuskulaturen kan åstadkommas med olika medel, e.g., excentrisk övning, frys skada, injektion av BaCl2 eller injektion av orm gifter såsom cardiotoxin eller notexin18. Medan excentrisk övning är förmodligen den mest fysiologiska skadan metod, skadan på en viss muskel är endast begränsad20. Frysskador kan tillämpas när migration av satellit celler mot platsen för skadan är syftet med studien eller endast en viss del av muskeln bör skadas. Experimentellt nackdelen med frysskador är den öppna kirurgi som måste utföras för att tillämpa den förtryckta metall sonden. Injektion av BaCl2 eller orm gifter är den mest dramatiska metoden för skada, vilket utmanande satellit cell funktion mest. Dessutom är injektionen minimalt invasiv, kirurgi tid, i allmänhet, är mindre än fem minuter och innebär inte suturering, etc. vilket minimerar risken för infektioner.
Muskel skada används främst för att undersöka de funktionella konsekvenserna av förlust av gen funktioner, t. ex., förlust av Pax77,21. Särskilt om åldrade möss är i fokus för den vetenskapliga frågan, är generering eller användning av transgena möss ofta inte genomförbart. Injektion av självförsörjande siRNAs som riktar sig mot en specifik gen är ett lönsamt alternativ i dessa fall och har använts framgångsrikt22. I korthet, tibialis främre muskeln av möss skadades genom injektion av cardiotoxin och Self-levererande sirnas riktade mot Fibronektin (FN) injicerades på dag 3 efter skada. Musklerna analyserades 10 dagar efter skada och en signifikant minskning av antalet satellit celler observerades i siFN kontra kodade siRNA kontrollförhållanden. Den knockdown effektivitet bestämdes i hela muskler celllysat av kvantitativa real tid PCR 2 dagar efter siRNA injektion, en minskning av uttrycks nivåer på 58% uppnåddes tyder på att leverans och knockdown effektivitet är tillräckliga för funktionella analyser22. Alternativ för att testa knockdown effektivitet är antingen immunoblot eller immunofluorescensanalyser med antikroppar riktade mot målgenen. Effektiviteten och specificiteten hos siRNA som används för in vivo injektioner bör bestämmas före injektion i möss, t. ex., genom att testa effektiviteten i isolerade satellit celler eller primära myoblasts. Användningen av en smart pool bestående av 4 olika siRNAs kontra en enda siRNA ökar effektiviteten av knockdown men ökar också risken för ospecifik inriktning. Specificiteten hos alla siRNA-sekvenser som används bör testas i cellkulturen för att undvika off-Target effekter. Som en kontroll, en icke-riktade kodade siRNA bör användas eftersom injektionen av en siRNA i sig kan påverka regenereringsprocessen på grund av injektion och därmed ytterligare skador på muskeln. Tidspunkten för injicering av siRNA beror på den vetenskapliga frågan och på uttrycks profilen för målgenen. Generellt, en injektion av självförsörjande siRNA på dag 3 efter kardiotoxin skada mål de flesta gener viktiga för satellit cell spridning sedan satellit cell spridning toppar runt dag 3 efter skada. Tidspunkten för den första siRNA injektion bör inte vara mindre än 48 h efter kardiotoxin skada eftersom injektionsvolymen av cardiotoxin är ganska hög och reabsorption av vätskan bör ha ägt rum innan du injicerar ytterligare lösningar i muskeln. I allmänhet är multipla injektioner av siRNAs eller en kombination av olika siRNAs möjligt även om man måste tänka på att varje injektion i regenererande muskeln orsakar ytterligare skador.
En begränsning av den beskrivna metoden är det faktum att den observerade effekten inte nödvändigtvis endast beror på knockdown av målgenen i satellit celler, men kan tillskrivas andra celltyper såsom immunceller eller fibro-adipogenic progenitorceller. Därför är det nödvändigt att kombinera dessa experiment med experiment som undersöker en ren population av satellit celler. Man kan antingen utföra experiment med flytande myofiber kulturer, där satellit celler odlas på deras angränsande myofibers eller utföra transplantations experiment med isolerade satellit celler17.
Ett alternativ till injektion av själv leverans ande siRNAs är injektion av småmolekylära hämmare eller rekombinanta proteiner som kan utföras, beroende på den vetenskapliga frågan. Till exempel, injektion av det extracellulära matrix proteinet Fibronektin eller små molekyler hämmare av Jak/stat signalering har framgångsrikt utförts i åldern möss15,16. Analysen av en viss genfunktion i en specifik celltyp vid regenerering av skelettmuskulaturen, t. ex., i satellit celler, är endast möjlig genom användning av en inducerbar genetisk musmodell. Injektioner av självförsörjande siRNAs, rekombinanta proteiner eller små molekyler hämmare kan påverka flera celltyper i regenererande skelettmuskulaturen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |