Vi beskriver en in vivo metode til at undersøge den funktionelle tab af et bestemt gen i satellit celler ved hjælp af en kombination af kardiotoksiner medieret skade på skeletmuskulatur og injektion af en selv-levere siRNA.
Skeletmuskulatur besidder en enorm kapacitet til at regenerere efter skade. Denne proces er primært drevet af muskel stamceller, også kaldet satellit celler. Satellit celler er karakteriseret ved ekspression af transkriptionsfaktoren Pax7 og deres placering under basal lamina i hvile skeletmuskulaturen. Ved skade, satellit celler bliver aktiveret, undergår selvfornyelse eller differentiering til enten danne nye myofibers eller til at smelte med beskadigede dem. Funktionaliteten af satellit celler in vivo kan undersøges ved hjælp af en kardiotoksiner baseret skade model af skeletmuskulatur. For at studere funktionen af et gen under regenerering af skeletmuskulatur, er transgene musemodeller for det meste brugt. Her præsenterer vi en alternativ metode til Transgene mus, til at undersøge genfunktionen i satellit celler under regenerering, fx i tilfælde, hvor Transgene mus ikke er tilgængelige. Vi kombinerer kardiotoksiner medieret skade af en bestemt skeletmuskulatur med injektion af en selv-levere siRNA i regenererende muskler, som derefter tages op af satellit celler blandt andre celler. Derved giver vi en metode til at analysere genfunktion i satellit celler under regenerering under fysiologiske forhold uden behov for Transgene mus.
Skeletmuskulatur er kroppens største væv, der repræsenterer ca. 40% af den samlede legemsvægt, hvilket muliggør frivillig bevægelse. Vævs arkitekturen i skeletmuskulaturen består hovedsageligt af postmitotiske, terminalt differentierede, flerkernede myofibers samt forskellige andre celler fra det perifere nervesystem, vaskulære system og interstitielle celler1. Vigtigere, skeletmuskulatur har en enorm kapacitet til at regenerere og genoprette funktion ved skader eller skader2. Denne proces afhænger af vævs Resident muskel stamceller også kaldet satellit celler3,4. Satellit celler er placeret mellem myofiber og basal lamina og karakteriseret ved ekspression af transkriptionsfaktoren Pax75,6,7. Under homeostatiske forhold, satellit celler er latent, men bliver aktiveret på grund af traumatisk skade, fx gennem excentrisk motion eller eksperimentelt gennem injektion af slangen Venom cardiotoxin6,8. Når det er aktiveret, Pax7 positive satellit celler Co-Express MyoD og Myf5, som forpligter stamceller til myogenic differentiering. Satellit celler, der modstå docetaxels opregulering af engagement faktorer vil bevare deres stemthed potentiale og vende tilbage til inaktive at genopbygge stamcelle pulje for fremtidige krav. Efter udvidelsen af den myogene stamcelle pulje, er transkriptionelle netværk aktiveret ved differentierings faktorer som Myogenin at initiere cellen cyklus exit og terminal differentiering. Disse myoprogenitorer smelter derefter til hinanden eller til eksisterende myofibers, som bidrager med myonuclei, for at opretholde størrelsen af det myonukleare domæne. Den myofibers Express Terminal muskel differentiering gener som myosin tunge kæde. Endelig, de nyligt dannede myofibers vokse og modne til at bygge de funktionelle enheder af skeletmuskulatur9,10.
Regenerering af skeletmuskulatur kan påvirkes af forskellige tilstande, herunder muskelsygdomme eller aldring11,12, lige fra milde funktionsnedsættelser til livstruende tilstande, f. eks, i Duchenne muskuløs dystrofi13 , 14. Derfor har regenerativ medicin til formål at genoprette beskadigede eller funktionssvigt skeletmuskulatur væv ved hjælp af sin iboende regenerativ effekt ved at målrette satellit celle funktion15,16. At bruge sit fulde potentiale en omfattende forståelse af satellit celler i deres endogene niche under regenerering af skeletmuskulatur er påkrævet. Selv om der findes eksperimentelle tilgange til at isolere satellit celler ved siden af deres myofibers17, kan den fulde kompleksitet af cellulære og systemiske interaktioner af satellit celler med deres miljø kun gentages in vivo. I denne henseende, stor viden om skeletmuskulatur regenerering er erhvervet ved hjælp af muse skade modeller2,18.
Her introducerer vi en specifik eksperimentel muse skade model til at studere stamcelle medieret regenerering af kardiotoksiner-induceret skade af tibias forreste muskel in vivo. Kardiotoksiner, en slange afledt cytolytisk toksin, der forårsager myofiber depolarisering og nekrose, injiceres i tibias forreste muskel, som igen vil udløse vævs degeneration efterfulgt af regenerering. At analysere funktionen af gener under akut regenerering, selv-levere siRNAs injiceres på dag 3 efter skade, på toppen af satellit celle ekspansion. Forsøgsdyr ofres på forskellige tidspunkter og tibias forreste muskler opsamles. De dissekeret muskler er frosset og forarbejdet til yderligere kryo-skæring. Immunofluorescens mikroskopi bruges derefter til at analysere markører for regenerering. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af funktionen af et enkelt gen under satellit celle drevet regenerering af skeletmuskulatur ved hjælp af vildtype mus.
Her præsenterer vi en metode til at undersøge funktionen af et bestemt gen under regenerering af skeletmuskulatur uden behov for transgene dyr. Dette opnås ved kombinationen af kardiotoksiner induceret muskelskade med injektion af en selv-levere siRNA i regenererende skeletmuskulatur på dag 3 efter skade. Vi har beskrevet i detaljer procedurerne for muskelskade ved kardiotoksiner, injektion af den selv-levere siRNA og behandling af de høstede muskler til at analysere udviklingen af regenerering. Vi viser, at injektion af slangen Venom cardiotoxin i skeletmuskulatur effektivt skader hele musklen, og at selv-levere siRNAs findes i omkring 75% af alle satellit celler blandt andre celletyper to dage efter deres injektion i regenererende skeletmuskulatur (figur 4, figur 5).
Særlig opmærksomhed bør fokuseres på en homogen skade af tibias forreste muskel, da varierende grader af skade påvirker regenererings resultatet og dermed også virkningen af siRNA kan blive påvirket. Desuden er det afgørende vigtigt, at hele regenererende område injiceres med den selv-levere siRNA. Til analyse af regenereringsprocessen, anbefales det altid at sammenligne lignende områder af regenererende skeletmuskulatur, derfor tibias forreste muskel bør skæres i halve til altid at sammenligne midten af maven regionen af musklen. Når du analyserer musklen, hele cryosection skal analyseres, da myofiber sammensætning adskiller sig i tibias forreste muskel og kan derfor regenerere forskelligt.
Funktionen af satellit celler kan undersøges ved forskellige eksperimentelle procedurer, herunder deres kultur på de tilstødende isolerede enkelt myofibers17, ved transplantation og ved at analysere regenerering af skeletmuskulatur efter induceret skade 18,19. Undersøge funktionen af satellit celler ved hjælp af en in vivo induceret skade model, fx, injektion af kardiotoksiner, giver mulighed for at analysere satellit celle funktion også i form af deres interaktion med andre celletyper såsom makrofager og undersøgelse af indflydelsen af systemiske faktorer2. Skade på skeletmuskulatur kan opnås ved forskellige midler, fx excentrisk motion, fryse skade, injektion af BaCl2 eller injektion af slange venomer såsom kardiotoksiner eller notexin18. Mens excentrisk motion er formentlig den mest fysiologiske skade metode, er skaden på en bestemt muskel kun begrænset20. Fryse skader kan anvendes, når migrationen af satellit celler mod stedet for skade er formålet med undersøgelsen eller kun en bestemt del af musklen skal være såret. Eksperimentelt Ulempen ved fryse skader er den åbne kirurgi, som skal udføres for at anvende den forkølede metal sonde. Injektion af bacl2 eller slange hymenopteragifte er den mest dramatiske metode til skade, og dermed udfordrende satellit celle funktion mest. Desuden er injektionen minimalt invasiv, kirurgi tid, i almindelighed, er mindre end fem minutter og ikke involverer suturering, etc. derved minimerer risikoen for infektioner.
Muskelskade er for det meste bruges til at undersøge de funktionelle konsekvenser af tab af genfunktioner, f. eks, tab af Pax77,21. Især hvis ældre mus er i fokus i det videnskabelige spørgsmål, er generering eller brug af Transgene mus ofte ikke muligt. Injektion af selv-levere siRNAs rettet mod et bestemt gen er et levedygtigt alternativ i disse tilfælde og er blevet anvendt med succes22. Kort sagt, tibias forreste muskel af mus blev såret ved injektion af kardiotoksiner og selv-levere sirnas rettet mod fibronektin (FN) blev injiceret på dag 3 efter skade. Musklerne blev analyseret 10 dage efter skaden og et signifikant fald i satellit cellenumre blev observeret i sifn versus røræg siRNA kontrolbetingelser. Knockdown-effektiviteten blev fastlagt i hele muskel lysater ved kvantitativ realtids PCR 2 dage efter siRNA-injektion, blev der opnået en reduktion i ekspressions niveauerne på 58%, hvilket tyder på, at leverings-og Knockdown-effektiviteten er tilstrækkelig til funktionelle analyser22. Alternativer til afprøvning af Knockdown effektivitet er enten immun eller immunofluorescens analyser med antistoffer rettet mod målgenet. Effektiviteten og specificiteten af siRNA, der anvendes til in vivo-injektioner, bør bestemmes før injektion i mus, fx ved at afprøve effektiviteten i isolerede satellit celler eller primære myoblaster. Brugen af en smart pool bestående af 4 forskellige siRNAs versus en enkelt siRNA øger effektiviteten af Knockdown, men øger også risikoen for uspecifik målretning. Specificiteten af alle anvendte siRNA-sekvenser skal testes i cellekultur for at undgå off-Target effekter. Som en kontrol, bør en ikke-målretning røræg siRNA anvendes, da injektion af en siRNA per se kan påvirke regenerering proces på grund af injektion og dermed yderligere skader af musklen. Tidspunktet for injektion af siRNA er afhængig af det videnskabelige spørgsmål og af udtryks profilen for målgenet. Generelt, en injektion af selv-levere siRNA på dag 3 efter kardiotoksiner skade mål de fleste gener vigtige for satellit celle spredning siden satellit celle spredning toppe omkring dag 3 efter skade. Tidspunktet for den første siRNA injektion bør ikke være mindre end 48 h efter kardiotoksitis skade, da injektionsvolumenet af kardiotoksiner er ret højt, og reabsorption af væsken bør have fundet sted, før der injiceres yderligere opløsninger i musklen. Generelt er flere injektioner af siRNAs eller en kombination af forskellige siRNAs muligt, selv om man må antage, at hver injektion i den regenererende muskel forårsager yderligere skader.
En begrænsning af den beskrevne metode er den kendsgerning, at den observerede virkning ikke nødvendigvis kun afhænger af Knockdown af målgenet i satellit celler, men kan tilskrives andre celletyper såsom immunceller eller Fibro-adipogenic progenitorceller. Derfor er det nødvendigt at kombinere disse eksperimenter med eksperimenter, der undersøger en ren population af satellit celler. Man kan enten udføre eksperimenter ved hjælp af flydende myofiber kulturer, hvor satellit celler dyrkes på deres tilstødende myofibers eller udføre transplantation eksperimenter ved hjælp af isolerede satellit celler17.
Et alternativ til injektion af selv-levere siRNAs er injektion af små molekyle hæmmere eller rekombinante proteiner, som kan udføres, afhængigt af det videnskabelige spørgsmål. For eksempel, injektion af den ekstracellulære matrix protein fibronektin eller små molekyle hæmmere af Jak/stat signalering er blevet udført med succes i alderen mus15,16. Analysen af et bestemt gen funktion i en bestemt celletype under regenerering af skeletmuskulatur, f. eks, i satellit celler, er kun muligt ved hjælp af en inducerbar genetisk musemodel. Injektioner af selv-levere siRNAs, rekombinante proteiner eller små molekyle hæmmere kan påvirke flere celletyper i regenererende skeletmuskulatur.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |