우리는 골격 근의 중재 된 손상과 자가 전달 siRNA의 주입의 조합을 사용하여 위성 세포에서 특정 유전자의 기능적 손실을 조사하는 생체 내 방법을 설명합니다.
골격 근육은 부상 후 재생할 수있는 엄청난 능력을 가지고. 이 과정은 주로 근육 줄기 세포에 의해 구동, 또한 위성 세포라고. 위성 세포는 휴식 골격 근에서 전사 인자 Pax7 및 기저 층의 밑에 그들의 위치의 발현을 특징으로 한다. 부상시, 위성 세포는 활성화 얻을, 새로운 myofibers를 형성하거나 손상된 것들과 융합하기 위해 자기 갱신 또는 분화를 받아야. 생체 내 위성 세포의 기능은 골격 근의 심독소 기반 부상 모델을 사용하여 조사 될 수있다. 골격 근의 재생 동안 하나의 유전자의 기능을 연구하기 위해, 형질전환 마우스 모델은 주로 사용된다. 여기에서, 우리는 형질전환 마우스에 대한 대체 방법을 제시하고, 재생 중에 위성 세포에서 유전자 기능을 조사하기 위해, 예를 들어, 형질전환 마우스를 사용할 수 없는 경우에 제시한다. 우리는 특정 골격 근의 심장 독소 매개 상해를 다른 세포 중 위성 세포에 의해 채택되는 재생 근육으로 자체 전달 siRNA의 주입과 결합합니다. 이에 따라, 우리는 형질전환 마우스에 대한 필요 없이 생리적 조건하에서 재생 동안 위성 세포에서 유전자 기능을 분석하는 방법을 제공한다.
골격 근은 자발적인 운동을 가능하게 하는 총 체중의 약 40%를 나타내는 신체의 가장 큰 조직입니다. 골격근의 조직 구조는 주로 말초 신경계, 혈관 계통 및 간질 세포로부터의 다양한 다른 세포뿐만 아니라 후미, 말기 분화, 다누핵근섬유로로 구성된다 1. 중요한 것은, 골격 근은 부상 또는 손상 시 기능을 재생하고 복원 할 수있는 엄청난 능력을 가지고2. 이 과정은 또한 위성 세포라고 조직 상주 근육 줄기 세포에 따라 달라집니다3,4. 위성 세포는 근섬유와 기저 층층 사이에 위치하며 전사 인자 Pax75,6,7의발현을 특징으로 한다. 동압 조건하에서, 위성 세포는 정적이지만 외상성 부상으로 인해 활성화됩니다, 예를 들어, 편심 운동을 통해 또는 뱀 독 심장독소의주입을 통해 실험적으로6,8. 일단 활성화되면, Pax7 양성 위성 세포는 MyoD 및 Myf5를 공동 발현하여 줄기 세포를 myogenic 분화에 투입합니다. 약정 요인의 upregulation에 저항하는 위성 세포는 그들의 줄기 잠재력을 유지하고 미래 요구를 위해 줄기 세포 풀을 보충하기 위하여 정지로 돌아갑니다. 근생 전구 풀의 확장 후, 전사 네트워크는 세포 주기 출구 및 말단 분화를 개시하기 위해 Myogenin과 같은 분화 인자에 의해 활성화된다. 이들은 myoprogenitors는 그 때 myonuclear 도메인의 크기를 유지하기 위하여 myonuclei를 기여하는 기존 myofibers를 서로 융합합니다. myofibers는 Myosin 중사슬 같이 말단 근육 분화 유전자를 표현합니다. 마지막으로, 새로 형성된 근섬유는 성장하고 성숙하여골격근9,10의기능단위를 구축한다.
골격 근의 재생은 근육 질환 또는 노화 를 포함한 다양한 조건에 의해 영향을받을 수 있습니다11,12,생명을 위협하는 조건에 온화한 손상에 이르기까지, 예를 들어, Duchenne 근 이영양증13 , 14. 따라서 재생 의학은 위성 세포 기능15,16을대상으로 하여 고유의 재생 력을 사용하여 손상되거나 오작동하는 골격 근 조직을 복원하는 것을 목표로합니다. 골격 근의 재생 동안 그들의 내 인 성 틈새 시장에서 위성 세포의 포괄적인 이해의 전체 잠재력을 사용 하려면 필요. 그들의 myofibers에 인접한 위성 세포를 격리하기 위하여 실험적인 접근이 존재하더라도17,그들의 환경과 위성 세포의 세포 그리고 조직 상호 작용의 완전한 복잡성은 생체 내에서만 재충전될 수 있습니다. 그런 점에서, 골격 근 재생에 대한 큰 지식은 마우스 부상 모델2,18을사용하여 획득되었습니다.
여기서 우리는 생체 내에서 경골 전방 근육의 심독소 유도 손상의 줄기 세포 매개 재생을 연구하기 위해 특정 실험 마우스 손상 모델을 소개한다. 심폐소생술, 근섬유 탈분극 및 괴사를 일으키는 원인이 되는 뱀 유래 세포 용해 독소는, 차례차례로 재생에 선행된 조직 변성을 일으키는 원인이 되는 경골 전방 근육으로 주입됩니다. 급성 재생 동안 유전자의 기능을 분석하기 위해, 자기 전달 siRNAs는 부상 후 3 일째에 주입, 위성 세포 확장의 절정에. 실험 동물은 다양한 시점에서 희생되고 경골 전방 근육이 수집됩니다. 해부된 근육은 동결되고 추가 저온 절편을 위해 처리됩니다. 면역 형광 현미경 검사법은 재생의 마커를 분석하기 위하여 그 때 이용됩니다. 이 방법은 야생형 마우스를 사용하여 골격근의 위성 세포 구동 재생 동안 단일 유전자의 기능을 조사할 수 있게 한다.
여기에서 우리는 형질전환 동물의 필요 없이 골격 근의 재생 도중 특정 유전자의 기능을 조사하는 방법을 제시합니다. 이것은 심장 독 소 유도 근육 상해의 조합에 의해 달성 되 고 자기 전달 siRNA 의 주입에 회생 골격 근육에 3 부상 후. 우리는 심동 독소에 의한 근육 손상의 절차를 자세히 설명했으며, 자가 전달 siRNA의 주입 및 수확 된 근육의 처리로 재생의 진행 상황을 분석했습니다. 우리는 뱀 독 심장 독소의 주입이 골격 근육에 효과적으로 전체 근육을 손상시키고 자기 전달 siRNAs는 다른 세포 유형 중 모든 위성 세포의 약 75 %에서 발견된다는 것을 보여줍니다 2 일 골격 근을 재생(그림 4, 그림 5).
상해의 다양한 정도가 재생 결과에 영향을 미치기 때문에 특히주의는 경골 전방 근육의 균일 한 상해에 집중되어야하고 따라서 siRNA의 효과도 영향을받을 수 있습니다. 더욱이, 전체 재생 영역이 자가 전달 siRNA로 주입되는 것이 매우 중요하다. 재생 과정의 분석을 위해, 항상 재생 골격 근육의 유사한 영역을 비교하는 것이 좋습니다, 따라서, 경골 전방 근육은 항상 항상 근육의 중간 배 꼽 영역을 비교하기 위해 반으로 절단해야합니다. 근육을 분석할 때, myofiber 조성물은 경골 전방 근육에서 다르기 때문에 전체 냉동 절을 분석할 필요가 있고 그러므로 다르게 재생될 수 있습니다.
위성 세포의 기능은 인접한 단하나 myofibers(17)에그들의 배양을 포함하여 각종 실험 절차에 의해 조사될 수 있습니다, 이식에 의하여 및 유도된 상해 후에 골격 근의 재생을 분석하 여 18,19. 생체 내 유도 된 상해 모델을 사용 하 여 위성 세포의 기능을 조사, 예를 들어, 심장 독 소의 주입, 또한 대 식 세포와 같은 다른 세포 유형과의 상호 작용 측면에서 위성 세포 기능을 분석 하는 기능을 제공 하 고 전신 요인의 영향에 대한 조사2. 골격근의 상해는 다양한 수단, 예를 들어, 편심 운동, 동결 상해, BaCl2의 주사 또는 심폐소독소 또는 노펙신(noexin)과 같은 뱀 독의 주사에 의해 달성될 수있다 18. 편심 운동은 아마 가장 생리적 인 부상 방법이지만, 하나의 특정 근육에 대한 부상은 제한20. 동결 상해는 상해의 사이트를 향해 위성 세포의 이동이 연구의 목적또는 근육의 특정 부분만 상해되어야 할 때 적용될 수 있습니다. 실험적으로 동결 부상의 단점은 미리 냉각 된 금속 프로브를 적용하기 위해 수행 할 필요가 있는 개방 수술입니다. BaCl의 주입2 또는 뱀 독 부상의 가장 극적인 방법, 따라서 가장 도전 위성 세포 기능. 더욱이, 주사는 최소침습, 수술 시간, 일반적으로 5분 미만이며 봉합 등을 수반하지 않으므로 감염의 위험을 최소화한다.
근육 손상은 주로 Pax77,21의손실과 같은 유전자 기능 상실의 기능적 결과를 조사하는 데 사용됩니다. 특히 숙성된 마우스가 과학적 질문의 초점이되는 경우, 형질전환 마우스의 생성 또는 사용은 종종 가능하지 않습니다. 특정 유전자를 표적으로 하는 자가 전달 siRNAs의 주입은 그 경우에 실행 가능한 대안이고 성공적으로22를이용되었습니다. 간단히 말해서, 마우스의 경질 전방 근육은 카디오톡신의 주입에 의해 부상을 입었으며, 섬유넥틴(FN)에 대한 지시된 siRNAs는 부상 후 3일째에 주입되었다. 근육은 부상 후 10일 및 스크램블된 siRNA 대조 군지 에서 siFN에서 현저한 감소가 관찰되었다. 녹다운 효율은 siRNA 주입 후 2일 간 정량적 실시간 PCR에 의해 전체 근육 용해로 결정되었으며, 발현 수준의 감소는 58%의 감소를 달성하여 전달 및 녹다운 효율이 기능적에 충분하다는 것을 시사하였다. 분석22. 녹다운 효율을 시험하기 위한 대안은 표적 유전자에 대하여 지시된 항체를 가진 면역 블롯 또는 면역 형광 분석입니다. 생체 내 주사에 사용되는 siRNA의 효율성 및 특이성은 마우스로 주입하기 전에 결정되어야 하며, 예를 들어, 단리된 위성 세포 또는 1차 근세포에서의 효율을 테스트하여 결정되어야 한다. 단일 siRNA대 4개의 상이한 siRNA로 구성된 스마트 풀을 사용하면 녹다운의 효율이 증가하지만 비특이적 타겟팅의 위험도 증가합니다. 사용된 모든 siRNA 서열의 특이성은 오프 표적 효력을 피하기 위하여 세포 배양에서 시험되어야 합니다. 대조군으로서, 비표적화 스크램블된 siRNA는 se당 siRNA의 주사가 주사로 인한 재생 과정에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 근육의 추가적인 손상에 영향을 미칠 수 있기 때문에 사용되어야 한다. siRNA를 주입하는 시점은 과학적 질문과 표적 유전자의 발현 프로필에 따라 다름있다. 일반적으로, 심장 독소 부상 후 3 일째에 자가 전달 siRNA의 주사는 위성 세포 증식에 중요한 대부분의 유전자를 대상으로 부상 후 3 일 주위에 위성 세포 증식 피크. 첫 번째 siRNA 주입에 대 한 시간 보다 더 이어야 한다 48 심장 독 소 부상 후 시간 심장 독 소의 주입 볼륨은 매우 높은 액체의 재흡수 근육에 추가 솔루션을 주입 하기 전에 자리를 차지 해야. 일반에, siRNAs의 여러 주사 또는 다른 siRNAs의 조합은 가능 하지만 하나는 재생 근육에 각 주사 는 추가 손상을 일으키는 고려 해야 합니다.
기재된 방법의 한 가지 제한은 관찰된 효과가 반드시 위성 세포에서 표적 유전자의 녹다운에 만 의존하는 것이 아니라 면역 세포 또는 섬유-지방종 전구 세포와 같은 다른 세포 유형에 기인할 수 있다는 사실이다. 따라서, 위성 세포의 순수한 집단을 조사하는 실험과 그 실험을 결합할 필요가 있다. 하나는 부동 myofiber 배양을 사용하여 실험을 수행 하거나, 위성 세포는 그들의 인접 한 myofibers에 배양 또는 분리 된 위성 세포를 사용 하 여 이식 실험을 수행17.
자가 전달 siRNAs의 주입에 대 한 대안은 작은 분자 억제제 또는 재조합 단백질의 주입, 과학적 질문에 따라 수행 될 수 있는. 예를 들어, 세포외 매트릭스 단백질 fibronectin 또는 JAK/STAT 신호의 소분자 억제제의 주사는15,16세마우스에서 성공적으로 수행되었다. 골격 근의 재생 동안 하나의 특정 세포 유형에서 특정 유전자 기능의 분석, 예를 들어, 위성 세포에서, 유도성 유전 마우스 모델의 사용을 통해 가능하다. 자기 전달 siRNAs의 주사, 재조합 단백질 또는 작은 분자 억제제 는 골격 근육을 재생에 여러 세포 유형에 영향을 미칠 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |