通过物理和各向异性扩张对人体组织部分的纳米成像
Summary
临床组织样本的纳米成像可以增进对疾病发病机制的认识。扩张病理学 （ExPath） 是扩展显微镜 （ExM） 的一个版本，经过修改，与标准临床组织样本兼容，使用传统的衍射受限显微镜探索生物分子的纳米级配置。
Abstract
在现代病理学中，光学显微镜通过揭示临床标本的微观结构在疾病诊断中起着重要的作用。然而，在使用传统的光学成像方法时，基本的物理衍射极限可以防止对纳米级解剖学和细微的病理变化进行询问。在这里，我们描述了一种简单而廉价的方案，称为扩张病理学（ExPath），用于常见类型的临床初级组织标本的纳米级光学成像，包括固定冷冻或形式固定石蜡嵌入（FFPE）组织部分。该方法通过化学化地将组织样品转化为组织水凝胶杂交，并在纯水中的多个尺度上物理地将其向各向异性扩展，从而规避了光学衍射极限。由于膨胀，以前无法解析的分子被分离，因此可以使用传统的光学显微镜进行观察。
Introduction
在三维（3D）环境下研究组织的分子组织，可以为生物功能和疾病发展提供新的了解。然而，这些纳米级环境超出了传统衍射有限显微镜（200~300nm）的分辨率，其中最小可解距，d由d <!–
–> +/NA定义。这里*是光的波长，NA是成像系统的数值孔径 （NA）。最近，新开发的超分辨率成像技术1、2、3，包括刺激发射消耗（STED），使荧光标记分子的直接可视化成为可能，光激活定位显微镜 （PALM）、随机光学重建显微镜 （STORM） 和结构化照明显微镜 （SIM）。尽管这些成像技术彻底改变了对纳米尺度生物功能的理解，但实际上，它们往往依赖于昂贵的和/或专门的设备和图像处理步骤，与传统的光学成像，需要具有特定特性（如光切换能力和/或高光稳定性）的荧光光道。此外，在组织标本上执行 3D 超分辨率成像仍是一项挑战。
膨胀显微镜 （ExM） 于 2015 年首次推出4，通过物理膨胀嵌入在可膨胀聚电解质水凝胶中的保存样品，提供了成像纳米尺度特征（<70 nm）的替代方法。在这里，关键生物分子和/或标签原位固定在聚合物网络中，在化学处理后可以异位扩展。由于物理膨胀提高了总有效分辨率，因此可以使用传统的衍射限制成像系统解决感兴趣的分子。自原始协议发布以来，定制合成荧光标签被固定在聚合物网络4上，新的策略被用来直接锚定蛋白质（蛋白质保留ExM，或proExM）5， 6、7、8、9和 RNA9、10、11、12到水凝胶，并通过迭代增加物理放大倍率膨胀13或适应凝胶化学8，14，15。
在这里，我们提出了proExM的改编版本，称为扩张病理学（ExPath）16，它已被优化的临床病理格式。该协议将临床样本（包括正式固定石蜡嵌入 （FFPE）、血氧林和 eosin （H&E） 染色，以及安装在玻璃幻灯片上的新鲜冷冻人体组织标本转换为与 ExM 兼容的状态。蛋白质然后锚定在水凝胶和机械均质执行 （图 1）16.通过样品4倍线性扩展，可以使用分辨率仅为±300 nm的传统共聚焦显微镜获得多色超分辨率（±70 nm）图像，还可以与其他超分辨率成像技术相结合。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们介绍ExPath协议16，proExM5的变体，可应用于病理学中最常用的临床活检样本类型，包括FFPE、H&E染色和玻璃玻片上新鲜冷冻的标本。标本的格式转换、抗原检索和免疫染色遵循不特定于 ExPath 的常用协议。与原来的proExM协议9不同，ExPath依赖于消化缓冲液中EDTA的更高浓度，这改善了形式固定组织的扩展，如最初的ExPath研?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了卡内基梅隆大学（YZ）的学院创业基金和NIH主任的新创新者奖（DP2 OD025926-01至YZ）的支持。
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
Riferimenti
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