Nanoscopische beeldvorming van menselijke weefsel secties via fysische en isotrope expansie
Summary
Nanoschaal beeldvorming van klinische weefselmonsters kan het begrip van ziekte pathogenese verbeteren. Expansie pathologie (ExPath) is een versie van expansie microscopie (ExM), aangepast voor compatibiliteit met standaard klinische weefselmonsters, om de nanoschaal configuratie van biomoleules te verkennen met conventionele diffractie beperkte microscopen.
Abstract
In de moderne pathologie speelt optische microscopie een belangrijke rol bij de diagnose van de ziekte door microscopische structuren van klinische specimens te onthullen. De fundamentele fysieke diffractie-limiet voorkomt echter ondervraging van de anatomie van nanoschaal en subtiele pathologische veranderingen bij het gebruik van conventionele optische beeldvormings benaderingen. Hier beschrijven we een eenvoudig en goedkoop protocol, genaamd Expansion pathologie (ExPath), voor optische beeldvorming op nanoschaal van veelvoorkomende soorten van klinisch primaire weefsel specimens, waaronder zowel vaste-bevroren of formalin-vaste paraffine ingesloten (FFPE) weefsel Secties. Deze methode omzeilt de optische diffractie grens door de weefselmonsters chemisch te transformeren in weefsel-hydrogel hybride en ze fysiek uit te breiden op meerdere schalen in zuiver water. Als gevolg van expansie worden voorheen niet-omgezette moleculen gescheiden en kunnen ze dus worden geobserveerd met een conventionele optische Microscoop.
Introduction
Onderzoek naar de moleculaire organisatie van weefsels in een driedimensionale (3D) context kan een nieuw begrip van biologische functies en ziekte ontwikkeling bieden. Echter, deze nanoschaal omgevingen zijn buiten de resolutie capaciteiten van conventionele diffractie beperkt microscopen (200 − 300 nm), waarbij de minimale omgezet afstand, d wordt gedefinieerd door d α <!–
–> λ/na. Hier λ is de golflengte van licht en na is het numerieke diafragma (na) van het beeldvormings systeem. Recentelijk is directe visualisatie van fluorescently gelabelde moleculen mogelijk gemaakt door nieuw ontwikkelde beeldvormingstechnieken met superresolutie1,2,3, inclusief gestimuleerde emissie depletie (STED), Foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM), stochastische optische reconstructie microscopie (STORM), en gestructureerde verlichtings microscopie (SIM). Hoewel deze beeldvormingstechnieken een revolutie hebben teweeggebracht in de biologische functie op nanoschaal, zijn ze in de praktijk vaak afhankelijk van dure en/of gespecialiseerde apparatuur en beeldverwerkings stappen, kunnen ze een langzamere acquisitie tijd hebben in vergelijking met conventionele optische beeldvorming, vereisen fluoroforen met specifieke kenmerken (zoals fotoswitchingvermogen en/of hoge foto stabiliteit). Daarnaast blijft het een uitdaging om 3D Super-Resolution Imaging op weefsel specimens uit te voeren.
Expansie microscopie (EXM), voor het eerst geïntroduceerd in 20154, biedt een alternatieve manier van Imaging nanoschaal kenmerken (< 70 nm) door fysiek groeiende bewaard gebleven monsters ingebed in een opzwelbaar polyelektrolyt hydrogel. Hier worden belangrijke biomoleules en/of labels in situ verankerd aan een polymeer netwerk dat isotopen kan worden uitgebreid na chemische verwerking. Omdat de fysieke expansie de totale effectieve resolutie verhoogt, kunnen moleculen van belang dan worden opgelost met conventionele diffractie-beperkte beeldvormingssystemen. Sinds de publicatie van het oorspronkelijke protocol, waarbij aangepaste gesynthetiseerde fluorescerende labels werden verankerd aan het polymeer netwerk4, zijn nieuwe strategieën gebruikt om direct eiwitten (eiwit retentie EXM of proexm) te verankeren5, 6,7,8,9 en RNA9,10,11,12 aan de hydrogel, en verhoog de fysieke vergroting door iteratief uitbreiding13 of aanpassing gelchemie 8,14,15.
Hier presenteren we een aangepaste versie van proExM, genaamd Expansion pathologie (ExPath)16, die is geoptimaliseerd voor klinische pathologie-formaten. Het protocol converteert klinische monsters, waaronder formalin-Fixed paraffine-ingebed (FFPE), hematoxyline en eosine (H & E) gekleurd, en vriesverse menselijke weefsel specimens die op glazen platen zijn gemonteerd, in een toestand die verenigbaar is met ExM. Eiwitten worden vervolgens verankerd aan de hydrogel en mechanische homogenisatie wordt uitgevoerd (Figuur 1)16. Met een 4-voudige lineaire expansie van de monsters, kunnen Multicolor superresolutie (~ 70 nm) beelden worden verkregen met behulp van een conventionele confocale Microscoop met slechts een ~ 300 nm resolutie en kan ook worden gecombineerd met andere Super-Resolution Imaging technieken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we de ExPath protocol16, een variant van proExM5 die kan worden toegepast op de meest voorkomende soorten klinische biopsie monsters gebruikt in pathologie, met inbegrip van ffpe, H & E gekleurd, en vers-bevroren specimens op glazen glijbanen. Format conversie, antigeen retrieval en immunokleuring van de specimens volgen veelgebruikte protocollen die niet specifiek zijn voor ExPath. In tegenstelling tot het oorspronkelijke proExM protocol9…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het faculteits startfonds van de Carnegie Mellon University (YZ) en de nieuwe Innovator Award van NIH Director (DP2 OD025926-01 tot YZ).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
Riferimenti
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
