הדמיה nanoscopic של מקטעים רקמות האדם באמצעות הרחבה גופנית איזוטרופית
Summary
ננו הדמיה של דגימות רקמה קלינית יכול לשפר את ההבנה של פתוגנזה מחלה. הרחבת פתולוגיה (ExPath) היא גרסה של התפשטות מיקרוסקופ (Expath), שונה עבור תאימות עם דגימות רקמה קלינית סטנדרטית, כדי לחקור את תצורת הננו-סקאלה של biomolecules באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונאלי עקיפה מוגבלת.
Abstract
בפתולוגיה המודרנית, מיקרוסקופ אופטי ממלא תפקיד חשוב באבחון המחלה על ידי חשיפת מבנים מיקרוסקופיים של דגימות קליניות. עם זאת, מגבלת העקיפה הפיזית הבסיסית מונעת חקירה של אנטומיה ננו-סקאלה ושינויים פתולוגיים עדינים בעת שימוש בגישות הדמיה אופטית קונבנציונאלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וזול, הנקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath), עבור הדמיה של ננו-סולם אופטי של סוגים נפוצים של דגימות הרקמה הראשונית קליני, כולל מוקפאו קבוע או formalin מוטבע הרקמה (FFPE) סעיפים. שיטה זו מרחיבה את מגבלת העקיפה האופטית באמצעות שינוי כימי של דגימות הרקמה לתוך רקמת-הידרוג’ל היברידית והרחבת הפיזית אותם באמצעות סולמות מרובים במים טהורים. בשל התרחבות, מולקולות שאינן פתירה בעבר מופרדות ובכך ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי.
Introduction
חקירת הארגון המולקולרי של רקמות בהקשר תלת מימדי (3D) יכול לספק הבנה חדשה של פונקציות ביולוגיות ופיתוח מחלות. עם זאת, סביבות ננומטרי אלה הם מעבר ליכולות הפתרון של עקיפה מוגבלת של מיקרוסקופים קונבנציונאלי (200-300 ננומטר), שם מרחק מינימלי לפתירה, d מוגדר על ידי d α <!–
–> λ/NA. כאן λ הוא אורך הגל של האור na הוא הפתח המספרי (NA) של מערכת ההדמיה. לאחרונה, הדמיה ישירה של מולקולות בעלי תווית fluorescently התאפשרה על-ידי החדש שפותחו ברזולוציה סופר טכניקות הדמיה1,2,3, כולל ממריצים פליטה מאולצת (ההיסטד), מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-מופעל (PALM), מיקרוסקופ שחזור (סטורם) סטוכסטי, ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM). למרות טכניקות הדמיה אלה יש מהפכה הבנה של תפקוד ביולוגי בקנה המידה, בפועל, הם לעתים קרובות להסתמך על ציוד יקר ו/או מיוחדים ועיבוד התמונה שלבים, יכול להיות זמן הרכישה איטי יותר השוואת ל הדמיה אופטית קונבנציונאלי, דורשים fluorophores עם מאפיינים ספציפיים (כגון יכולת מיתוג תמונה ו/או פוטויציבות גבוהה). בנוסף, הוא נשאר אתגר לבצע 3D ברזולוציה סופר הדמיה על דגימות רקמות.
מיקרוסקופ הרחבה (ExM), הוצג לראשונה בשנת 20154, מספק אמצעי חלופי של תכונות ננו הדמיה (< 70 ננומטר) על ידי הרחבה פיזית דגימות שנשמרו מוטבע בתוך הידרו פוליליטי swellable. כאן, מפתח biomolecules ו/או תוויות מעוגנים באתרו לרשת פולימר שניתן isotopically מורחב לאחר עיבוד כימי. מכיוון שהרחבת הגוף מגבירה את הרזולוציה האפקטיבית הכוללת, ניתן לפתור את מולקולות הריבית באמצעות מערכות הדמיה מוגבלות-עקיפה. מאז הפרסום של הפרוטוקול המקורי, שם תוויות פלורסנט מסונתז מותאם אישית היו מעוגנים לרשת פולימר4, אסטרטגיות חדשות שימשו ישירות עוגן חלבונים (חלבון שימור exm, או proExM)5, 6,7,8,9 ו-RNA9,10,11,12 להידרוג’ל, והגדל את ההגדלה הפיזית באמצעות איטרטיבי התרחבות13 או התאמת הכימיה ג’ל8,14,15.
כאן אנו מציגים גרסה מותאמת של proExM, נקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath)16, אשר כבר אופטימיזציה עבור תבניות פתולוגיה קלינית. הפרוטוקול ממיר דגימות קליניות, כולל פורמאלין קבוע-פרפין-מוטבע (FFPE), המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) ויטראז, וטרי-קפואים רקמות האדם הרכוב על שקופיות זכוכית, למצב תואם ExM. חלבונים מעוגנים אז ההידרוג’ל והומוגון מכני מבוצעת (איור 1)16. עם 4-מקפלים הרחבה ליניארית של דגימות, ברזולוציה ססגוניות (~ 70 nm) תמונות ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד קונבנציונאלי שיש רק ברזולוציה של ~ 300 ננומטר והוא יכול גם להיות משולב עם טכניקות אחרות סופר ברזולוציה הדמיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ExPath16, גרסה של proExM5 שניתן להחיל על הסוגים הנפוצים ביותר של דגימות ביופסיה קלינית בשימוש פתולוגיה, כולל ffpe, H & E ויטראז ‘, ויצורים קפואים טריים על שקופיות זכוכית. המרת עיצוב, שליפת אנטיגן, וכתמים חיסוני של הדגימות לעקוב אחר פרוטוקולים בשימוש…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי קרן הסטארט-up של הפקולטה מאוניברסיטת קרנגי מלון (YZ) ו-NIH החדש של מנהל משנה פרס (DP2 OD025926-01 עד YZ).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
Riferimenti
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
