Summary

Наноскопическое изображение секций тканей человека с помощью физического и изотропного расширения

Published: September 25, 2019
doi:

Summary

Наноразмерная визуализация образцов клинических тканей может улучшить понимание патогенеза болезни. Расширение патологии (ExPath) является версия расширения микроскопии (ExM), модифицированный для совместимости со стандартными клиническими образцами ткани, для изучения наномасштабной конфигурации биомолекул с помощью обычных дифракционных ограниченных микроскопов.

Abstract

В современной патологии оптическая микроскопия играет важную роль в диагностике заболеваний, выявляя микроскопические структуры клинических образцов. Однако фундаментальный предел физической дифракции предотвращает допрос наномасштабной анатомии и тонкие патологические изменения при использовании обычных оптических подходов к визуализации. Здесь мы описываем простой и недорогой протокол, называемый патологией расширения (ExPath), для наномасштабного оптического изображения общих типов клинических образцов первичной ткани, включая как фиксированные замороженные или формалин-фиксированный парафин встроенные (FFPE) ткани Разделы. Этот метод обходит предел оптической дифракции путем химического преобразования образцов тканей в гибрид ткани-гидрогеля и физически расширяя их изотрополено через несколько масштабов в чистой воде. Благодаря расширению, ранее неразрешимые молекулы отделяются и, таким образом, могут наблюдаться с помощью обычного оптического микроскопа.

Introduction

Исследование молекулярной организации тканей в трехмерном (3D) контексте может дать новое понимание биологических функций и развития болезней. Тем не менее, эти наноразмерные среды выходят за рамки возможностей разрешения обычных дифракционных ограниченных микроскопов (200–300 нм), где минимальное разрешимое расстояние, d определяется d q <!––> /NA. Здесь длина волны света и NA является численной диафрагмы (NA) системы визуализации. В последнее время прямая визуализация флуоресцентно маркированных молекул стала возможной благодаря недавно разработанным методам визуализации суперразрешения1,2,3,включая стимулирующее истощение выбросов (STED), фотоактивированная микроскопия локализации (PALM), стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и структурированная иллюминация микроскопии (SIM). Хотя эти методы визуализации произвели революцию в понимании биологической функции на наноуровне, на практике они часто полагаются на дорогостоящее и/или специализированное оборудование и этапы обработки изображений, могут иметь более медленное время приобретения по сравнению с обычные оптические изображения, требуют флюорофоров с конкретными характеристиками (например, возможность переключения фотографий и / или высокой фотостабильности). Кроме того, остается сложной задачей для выполнения 3D-супер-разрешение изображения на образцах тканей.

Микроскопия расширения (ExM), впервые введенная в 20154,обеспечивает альтернативное средство визуализации наноразмерных объектов (Злт;70 нм) путем физического расширения сохранившихся образцов, встроенных в набухаемый полиэлектролитовый гидрогель. Здесь ключевые биомолекулы и/или этикетки закреплены на месте в полимерной сети, которая может быть изотопно расширена после химической обработки. Поскольку физическое расширение увеличивает общее эффективное разрешение, молекулы, представляющие интерес, могут быть решены с помощью обычных систем визуализации с ограниченной дифракцией. С момента публикации оригинального протокола, где пользовательские синтезированные флуоресцентные этикетки были закреплены на полимерной сети4, новые стратегии были использованы для непосредственного якоря белков (задержка белка ExM, или proExM)5, 6,7,8,9 и РНК9,10,11,12 к гидрогелю, и увеличить физическое увеличение через итеративные расширение13 или адаптации гель химии8,14,15.

Здесь мы представляем адаптированную версию proExM, называемую патологией расширения (ExPath)16, которая была оптимизирована для форматов клинической патологии. Протокол преобразует клинические образцы, в том числе формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE), гематоксилин и эозин (H и E) окрашенных, и свежезамороженных человеческих тканей образцов, установленных на стеклянных слайдах, в состояние, совместимое с ExM. Белки затем прикрепляется к гидрогелю и выполняется механическая гомогенизация(рисунок 1)16. С 4-кратным линейным расширением образцов, многоцветные супер-разрешение (70 нм) изображения могут быть получены с помощью обычного конфокального микроскопа, имеющего только разрешение в 300 нм, а также могут быть объединены с другими методами визуализации супер-разрешения.

Protocol

1. Подготовка фондовых реагентов и решений Приготовьте компоненты раствора гелеобразующего.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация раствора приведена в g/mL (w/v процент). Сделать следующие фондовые решения: 38% (w/v) акрилат натрия (SA), 50% (w/v) акриламид (AA), 2% (w/v) N, N’-methylenebisacrylamide (Bis), и 29.2% (w/…

Representative Results

Если протокол был успешно выполнен(рисунок 1), образцы будут отображаться как плоский и прозрачный гель после механической гомогенизации(рисунок 3A) и может расшириться в 3-4,5x в воде(рисунок 3B), обеспечение эффективного р?…

Discussion

Здесь мы представляем протокол ExPath16, вариант proExM5, который может быть применен к наиболее распространенным типам клинических образцов биопсии, используемых в патологии, в том числе FFPE, H и E окрашенных, и свежезамороженных образцов на стеклянных слайдах. Преобр?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана юридическим фондом университета Карнеги-Меллона (Y) и премией директора NIH New Innovator Award (DP2 OD025926-01 в Y).

Materials

4-hydroxy-TEMPO (4HT) Sigma Aldrich 176141 Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) Cellvis P06-1.5H-N
Acetone Fischer Scientifc A18-500
Acrylamide Sigma Aldrich A8887
Acryloyl-X, SE (AcX) Invitrogen A20770
Agarose Fischer Scientifc BP160-100
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich A3678 Initiatior
Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit Sigma Aldrich HPA001873
Anti-Collagen IV antibody produced in mouse Santa Cruz Biotech sc-59814
Anti-Vimentin antibody produced in chicken Abcam ab24525
Aqua Hold II hydrophobic pen Scientific Device 980402
Breast Common Disease Tissue Array Abcam ab178113
DAPI (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248 Nuclear stain
Diamond knife No. 88 CM General Tools 31116
Ethanol Pharmco 111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M
VWR BDH7830-1
FFPE Kidney Sample USBiomax HuFPT072
Forceps
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A Biotium 20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 Biotium 20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010
MAXbind Staining Medium Active Motif 15253 Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.
MAXblock Blocking Medium Active Motif 15252 Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.
MAXwash Washing Medium Active Motif 15254 Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.
Micro cover Glass #1 (24x60mm) VWR 48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) VWR 48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)
Sigma Aldrich T9281 Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide Sigma Aldrich M7279
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121 For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish Thermo Fisher 167063 Multi-well plastic culture dish
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish Thermo Fisher 140675
Nunc 15mL Conical Thermo Fisher 339651
Nunc 50mL Conical Thermo Fisher 339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution Fischer Scientifc BP399-1
Plastic Petri Dish (100 mm) Fischer Scientifc FB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade) Thermo Scientific EO0491
Razor blade Fischer Scientifc 12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo Fisher 3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL Thermo Fisher 3459
Sodium acrylate Sigma Aldrich 408220
Sodium chloride Sigma Aldrich S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich C8532-1KG
Tris Base Fischer Scientifc BP152-1
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Wheat germ agglutinin labeled with CF640R Biotium 29026
Xylenes Sigma Aldrich 214736

Riferimenti

  1. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
  9. Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
  10. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  11. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
  12. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  14. Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
  15. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  16. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
check_url/it/60195?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Klimas, A., Bucur, O., Njeri, B., Zhao, Y. Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion. J. Vis. Exp. (151), e60195, doi:10.3791/60195 (2019).

View Video