Qui, presentiamo un protocollo per dissociare e ordinare una popolazione cellulare specifica dalle ghiandole accessorie maschili della Drosophila (cellule secondarie) per il sequenziamento dell'RNA e RT-qPCR. L'isolamento cellulare si realizza attraverso la purificazione FACS delle cellule secondarie che esprime GFP dopo un processo di dissociazione multifase che richiede dissezione, proteasi di gestione e dispersione meccanica.
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Articolo metodologico
Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per comprendere la funzione di un organo, è spesso utile comprendere il ruolo delle sue popolazioni cellulari costituenti. Sfortunatamente, la rarità delle singole popolazioni di cellule spesso rende difficile ottenere materiale sufficiente per studi molecolari. Ad esempio, la ghiandola accessoria del sistema riproduttivo maschile della Drosophila contiene due tipi distinti di cellule secretory. Le cellule principali costituiscono il 96% delle cellule secretory della ghiandola, mentre le cellule secondarie (SC) costituiscono il restante 4% delle cellule (circa 80 cellule per maschio). Sebbene entrambi i tipi di cellule producano componenti importanti del liquido seminale, solo pochi geni sono noti per essere specifici per le SCs. La rarità delle SC ha, finora, ostacolato lo studio di analisi trascrittomica di questo importante tipo di cellula. Qui, viene presentato un metodo che consente la purificazione delle SCs per l'estrazione e il sequenziamento dell'RNA. Il protocollo consiste nel sezionare prima le ghiandole da mosche che esprimono un reporter GFP specifico scmedico e poi sottoponendo queste ghiandole alla digestione proteasi e alla dissociazione meccanica per ottenere singole cellule. Seguendo questi passi, le cellule individuali, viventi, marcate TBC vengono ordinate utilizzando un sorter cellulare attivato fluorescente (FACS) per la purificazione dell'RNA. Questa procedura produce RNA specifici di SC da 40 maschi per condizione per il sequenziamento a valle di RT-qPCR e/o RNA nel corso di un giorno. La rapidità e la semplicità della procedura consentono di determinare in un breve periodo di tempo i trascrittomi di molte mosche diverse, provenienti da genotipi o condizioni ambientali diverse.
Introduzione
Gli organi sono costituiti da più tipi di cellule, ognuna con funzioni discrete e talvolta esprimi nobili di geni molto diversi. Per ottenere una comprensione precisa di come funziona un organo, è spesso fondamentale studiare ogni tipo di cellula distinta che costituisce questo organo. Uno dei metodi principali utilizzati per esplorare la possibile funzione è l'analisi del trascrittoma. Questo potente metodo fornisce un'istantanea dell'espressione genica in una cellula, per rivelare processi e percorsi attivi. Tuttavia, questo tipo di analisi è spesso difficile per le popolazioni di cellule rare che devono essere purificate da cellule vicine molto più abbondanti. Ad e....
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Protocollo
1. Linee di Drosophila utilizzate e raccolta dei maschi
- Per questo protocollo, utilizzare i maschi che esprimono GFP nelle SCs e non nelle cellule principali. In questo caso, viene utilizzato un driver AbdB-GAL4 (descritto nel riferimento18),ricombinato con UAS-GFP (sul cromosoma 2). Possono essere utilizzati anche altri driver appropriati. Per l'isolamento delle SC in diverse condizioni mutanti, attraversa la mutazione in linee contenenti la linea GFP specifica per SC.
- Raccogliere due lotti di circa 25 maschi sani e vergini per ogni genotipo e invecchiarli a 25 gradi centigradi per 3-4 giorni in f....
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Risultati
Il protocollo qui presentato consente a uno sperimentatore di isolare le cellule secondarie dalle ghiandole accessorie maschili della Drosophila e di estrarre il loro RNA nel corso di un solo giorno (Figura 1).
Usiamo il costrutto Abd-B-GAL4 18 per etichettare le celle secondarie (SC) ma non le celle principali (MC) con GFP(Figura 2
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Discussione
I metodi per la dissociazione cellulare dal tessuto della Drosophila come i dischi immaginari sono già descritti23. I nostri tentativi di utilizzare semplicemente queste procedure sulle ghiandole accessorie fallirono, incoraggiandoci a sviluppare questo nuovo protocollo. La digestione proteasi e la triturazione meccanica sono stati i passi critici che abbiamo colpito per il successo della procedura, e abbiamo quindi inserito molte note nelle sezioni da 2 a 5 per aiutare gli sperimentatori.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcuna divulgazione.
Ringraziamenti
Siamo grati ai membri del laboratorio Karch, alla piastra di genomica iGE3, alla struttura centrale Flow Cytometry dell'Università di Ginevra e al Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye che ha stabilito il protocollo per FACS. Ringraziamo Luca Stickley per il suo aiuto nella visualizzazione delle letture su IGV. Ci ringraziamo per il gentile permesso di riutilizzare le figure, e gli editori per averci spinto ad essere creativi con la scrittura.
Questa ricerca è stata finanziata dallo Stato di Ginevra (CI, RKM, FK), dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca (www.snf.ch) (FK e RKM) e dalle donazioni della Fondazione Claraz (FK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | VWR | 734-2325 | |
| Microscopio binoculare per dissezione | |||
| Binoculare con sorgente luminosa per GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0,3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Microprovette in plastica 1,5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Pinze per dissezione fine Siero | |||
| bovino fetale | Gibco | 10270-106 | inattivato a caldo prima dell'uso |
| Piatti di vetro per la dissezione | |||
| Secchiello | |||
| il ghiaccio Sistema di trascrizione inversa ImProm-II | Promega | A3800 | |
| Kit di purificazione dell'RNA MasterPure | Epicentro | MCR85102 | |
| Kit Nextera XT | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papaina | 50U/mL stock | ||
| PBS | fatto in casa | ||
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15070-063 | |
| Primer | |||
| Primer esamero casuale RNA | |||
| 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider' s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| Kit di sintesi di cDNA SMARTer | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix per CFX | applicato biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng strumenti | MS-100 | |
| Tipone 1250 μ Punta graduata a L | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μ Punta smussata a L | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
Riferimenti
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmen....
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Ristampe e permessi
