En Cryo-pulverization protokol til behandling af muse poter til at evaluere molekylære veje af vævs betændelse i en kollagen induceret arthritis model
Summary
En kryogen pulverisering metode til at behandle murine poter ved hjælp af en flydende kvælstof fryser mølle blev udviklet for at forbedre udbyttet og kvaliteten af RNA eller protein udvundet fra væv og gøre det muligt at analysere molekylære profiler forbundet med inflammatoriske Svar.
Abstract
Profilering af molekylære ændringer i lokalt væv er afgørende for at forstå virkningsmekanismen for terapeutiske kandidater in vivo. Inden for gigt forskning, mange undersøgelser er fokuseret på betænd leddene, der er sammensat af en kompleks blanding af knogler, brusk, muskel, stromale celler og immunceller. Her etablerede vi en pålidelig og robust mekanisk metode til at forstyrre inflammeret muse poter i homogene pulveriserede prøver i et kryogenisk kontrolleret miljø. Protein-og RNA-lysater blev behandlet for at muliggøre proteomiske og transkriptionelle endepunkter og molekylær karakterisering af relevante sygdoms veje i lokalt væv.
Introduction
Reumatoid arthritis (RA) er en kronisk systemisk inflammatorisk sygdom med persisterende symmetrisk synovitis i leddene og ekstra artikulær involvering af organer som hud, hjerte, lunger og øjne1. Selv om de systemiske manifestationer af immunresponset er tydelige hos mennesker, er et af kendetegnene ved RA-patologi infiltration af immunceller i vævet i synovialvæv og proliferation af synovial fibroblast celler2.
Svarende til human RA, mus kollagen induceret arthritis (CIA) model fremkalder stærk vævs betændelse med aktive immunrespons i synovialvæv og systemiske rum. Følsomheden af forskellige muse stammer til CIA model links til større histocompatibility Complex (MHC) haplotype og antigen specifikke T celle og B celle interaktioner3,4. Desuden, mange patogene veje i human RA, herunder autoantistof produktion, immunkompleks deposition, myeloid celle aktivering, polyartikulære manifestationer og pannus dannelse med synovial immun infiltration, er også tydeligt i denne model 5,6. Efterforskere har anvendt denne veletablerede CIA-model til at undersøge virkningerne af antiinflammatoriske cytokinbehandlinger7. Mange biologiske lægemidler godkendt til autoimmune eller inflammatoriske sygdomme, såsom anti-tnfα og anti-Il-6, er fundet at være effektive i CIA model8,9.
Profilering interaktioner af immunsystemet i synovialvæv er afgørende for at belyse molekylære mekanismer forbundet med patogenesen af RA. I den humane kliniske indstilling, en almindelig praksis er at udføre nåle synovial biopsier under vejledning af ultralyd Imaging. I de prækliniske indstillinger, den mindre arkitektur af murine leddene gør biopsi procedurer meget vanskeligere, hvis ikke umuligt. For nylig demonstrerede vi udnyttelsen af murine CIA-modellen for at evaluere kombinationer af lægemidler til at påvirke forskellige slutpunkter og løse sygdomme i en kombinatorisk tilgang10. En kryogen fryse mølle-baseret pulverisering metode blev anvendt til at behandle bettet murine poter i homogene fine pulvere og etablerede downstream processer til at udtrække RNA og proteiner. Denne metode beskytter RNA og protein fra enzymatiske og kemiske degrative processer og gør det muligt for os at anvende flere analytiske metoder til en enkelt homogeniseret prøve kilde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om der er stærke videnskabelige rationale til at evaluere molekylære veje i synovialvæv, mange rapporter om immun profilering af murine CIA model var fokuseret på perifert blod, mens protein og RNA analysedata af betonede poter er temmelig begrænset. Der er flere mulige årsager til denne skævhed: murine ankel leddene er ikke større end ~ 2 cm; de berørte områder består af hud, knogler og bindevæv, som ofte er svære at homogenisere ved hjælp af traditionelle metoder som vævs slibemaskiner, Pestle og m?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Edith Janssen for den kritiske gennemgang af manuskriptet og Navin Rao og Jennifer Towne for deres støtte til udgivelsen af dette manuskript.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
Riferimenti
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
