Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

Summary

Um método criogênico de pulverização para processar patas de urina usando um moinho congelador de nitrogênio líquido foi desenvolvido para melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a inflamatórios Respostas.

Abstract

O perfil de alterações moleculares nos tecidos locais é crucial para entender o mecanismo de ação dos candidatos terapêuticos in vivo. No campo da pesquisa da artrite, muitos estudos são focalizados nas junções inflamadas que são compostas de uma mistura complexa do osso, da cartilagem, do músculo, das pilhas estromais e das pilhas imunes. Aqui, estabelecemos um método mecânico confiável e robusto para interromper as patas inflamadas do rato em amostras pulverizadas homogêneas em um ambiente criogenicamente controlado. As lisatas proteicas e rna foram processadas para permitir desfechos proteômicos e transcricionais e caracterização molecular de vias de doenças relevantes no tecido local.

Introduction

A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória sistêmica crônica com sinofite simétrica persistente nas articulações e envolvimento articular extra de órgãos como a pele, coração, pulmões e olhos¹. Embora as manifestações sistêmicas da resposta imune sejam evidentes em pacientes humanos, uma das características da patologia da RA é a infiltração de células imunes no tecido sinovial e a proliferação de células fibroblastas sinoviais^2.

Semelhante ao AR humano, o modelo de artrite induzida por colágeno do rato (CIA) provoca forte inflamação do tecido com respostas imunes ativas em tecidos sinoviais e compartimentos sistêmicos. A susceptibilidade de diferentes cepas de camundongos para links modelo da CIA para Major Histocompatibilidade Complexo (MHC) haplótipo e antígeno específico célula T e interações celulares B^3,4. Além disso, muitas vias patogênicas na AR humana, incluindo a produção de autoanticorpos, deposição de complexo imune, ativação de células mieloides, manifestações poliarticulares e formação de pannus com infiltração imune sinovial, também são evidentes neste modelo ^5,6. Os investigadores empregaram este modelo bem estabelecido do CIA para investigar efeitos de tratamentos anti-inflamatórios da citocina^7. Muitos produtos biológicos aprovados para doenças auto-imunes ou inflamatórias, como anti-TNFα e anti-IL-6, são encontrados para ser eficaz no modelo da CIA^8,9.

O perfil das interações do sistema imunológico no tecido sinovial é crucial para elucidar os mecanismos moleculares associados à patogênese da AR. No ambiente clínico humano, uma prática comum é realizar biópsias sinoviais de agulha a orientação de imagens de ultrassom. Nas configurações pré-clínicas, a arquitetura menor das articulações de urina torna os procedimentos de biópsia muito mais difíceis, se não impossíveis. Recentemente, demonstramos a utilização do modelo murine CIA para avaliar combinações de drogas para impactar pontos finais díspares e resolver a doença em uma abordagem combinatória¹⁰. Um método criogênico de pulverização à base de uma fábrica de freezer foi empregado para processar patas de urina inflamadas em pós finos homogêneos e estabeleceu processos a jusante para extrair RNA e proteínas. Este método protege o RNA e a proteína dos processos degralísticos enzimáticos e químicos e permite-nos aplicar múltiplos métodos analíticos a uma única fonte homogênea da amostra.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as políticas do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Janssen R&D. 1. Método de Pulverização baseado em fábrica de freezer criogênico Na terminação do estudo do CIA, os ratos do sacrifício com isoflurane de 1.5% seguidos pela deslocação cervical. No dia do processamento de tecidos, pré-chill todos os instrumentos (espátulas, frascos de moagem, etc) em gelo seco por um mínimo de 1…

Representative Results

Aqui, nós mostramos uma visualização representativa da imagem do gel do RNA extraído das patas dianteiras de ratos do CIA na figura 2A. O rRNA 28S e a banda rRNA 18S indicam que todas as amostras têm quantidade suficiente de RNA intacto. Em seguida, mostramos um gráfico representativo de dispersão de concentrações totais de proteínas com base na análise de proteína BCA na Figura 2B. A…

Discussion

Embora haja uma forte lógica científica para avaliar as vias moleculares nos tecidos sinoviais, muitos relatórios sobre o perfil imunológico do modelo da CIA murine foram focados no sangue periférico, enquanto os dados de análise de proteínas e RNA de patas inflamadas são bastante limitados. Existem várias razões possíveis para este viés: as articulações do tornozelo murine não são maiores do que ~ 2 cm; as áreas afetadas consistem em tecidos de pele, osso e conjuntivo, que muitas vezes são difíceis de…

Materials

5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing