Analys för blod-hjärnbarriären integritet i Drosophila melanogaster
Summary
Blod-hjärnbarriären integritet är avgörande för nervsystemets funktion. I Drosophila melanogasterbildas blod-hjärnbarriären av glialceller under sen embryogenes. Detta protokoll beskriver metoder för att analys för blod-hjärnbarriären bildning och underhåll i D. melanogaster embryon och tredje INSTAR larver.
Abstract
Korrekt nervsystemet utveckling omfattar bildandet av den Blood-brain barriären, diffusions barriären som tätt reglerar tillgång till nervsystemet och skyddar nervvävnad från toxiner och patogener. Defekter i bildandet av denna barriär har korrelerats med neuropatier, och nedbrytningen av denna barriär har observerats i många neurodegenerativa sjukdomar. Därför är det viktigt att identifiera de gener som reglerar bildandet och underhållet av blod-hjärnbarriären för att identifiera potentiella terapeutiska mål. För att förstå de exakta rollerna dessa gener spelar i neurala utveckling, är det nödvändigt att analysen effekterna av förändrade genuttryck på integriteten av blod-hjärnbarriären. Många av de molekyler som fungerar i upprättandet av blod-hjärnbarriären har visat sig vara bevaras över eukaryota arter, inklusive bananfluga, Drosophila melanogaster. Fruktflugor har visat sig vara ett utmärkt modellsystem för att undersöka de molekylära mekanismerna som reglerar nervsystemets utveckling och funktion. Detta protokoll beskriver ett steg-för-steg-förfarande för att assay för blod-hjärnbarriären integritet under embryonala och larvstadier av D. melanogaster utveckling.
Introduction
Under utveckling, cell-cellkommunikation och interaktioner är avgörande för inrättandet av vävnad och organ struktur och funktion. I vissa fall, dessa cell-cell interaktioner tätning av organ från den omgivande miljön för att säkerställa korrekt organfunktion. Detta är fallet för nervsystemet, som isoleras av blod-hjärnbarriären (BBB). Dysfunktion av BBB hos människor har kopplats till neurologiska sjukdomar inklusive epilepsi, och nedbrytning av barriären har observerats i neurodegenerativa sjukdomar inklusive multipel skleros och amyotrofisk lateral skleros1. Hos däggdjur bildas BBB genom täta korsningar mellan endotelceller2,3. Andra djur, inklusive bananfluga, Drosophila melanogaster, har en BBB består av gliaceller. Dessa gliaceller celler bildar en selektivt permeabel barriär för att kontrollera rörligheten för näringsämnen, slaggprodukter, toxiner, och stora molekyler in i och ut ur nervsystemet4. Detta möjliggör underhåll av den elektrokemiska lutning som krävs för att avfyra actionpotentialer, möjliggör rörlighet och samordning4. I D. melanogasterskyddar glia nervsystemet från den kalium rika, blodliknande hemolymfa5.
I centralanervsystemet (CNS) och perifera nervsystemet (PNS) av D. melanogaster, två yttre glialskikt, subperineurial glia och perineurial glia, samt ett yttre nätverk av extracellulär matris, den neurala lamellerna, bildar den hemolymfa-hjärna och hemolymfa-nerv barriär6, kallad BBB hela denna artikel. Under utveckling subperineurial glia bli polyploida och förstora för att omge nervsystemet5,6,7,8,9,10,11 . Subperineurial glia bildar septate korsningar, som ger den huvudsakliga diffusion barriären mellan hemolymfa och nervsystemet5,6,12. Dessa korsningar är molekylärt liknar septate-liknande korsningar finns på paranodes av myelinating glia i ryggradsdjur, och de utför samma funktion som täta korsningar i BBB av däggdjur13,14, 15 , 16 , 17. den perineurial glia dividera, växa, och Linda runt subperineurial glia att reglera spridningen av metaboliter och stora molekyler6,10,18,19. BBB-bildningen är avslutad med 18,5 h efter äggläggningen (AEL) vid 25 ° c5,8. Tidigare studier har identifierat gener som är kritiska regulatorer av BBB-formation20,21,22. För att bättre förstå de exakta rollerna för dessa gener, är det viktigt att undersöka effekten av mutation av dessa potentiella tillsynsmyndigheter på BBB integritet. Medan tidigare studier har skisserat metoder för testmetoder BBB integritet i embryon och larver, ett omfattande protokoll för denna analys har ännu inte beskrivits5,7. Detta steg-för-steg-protokoll beskriver metoder för testmetoder BBB integritet under D. melanogaster embryonala och tredje INSTAR larvstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll ger en omfattande beskrivning av de steg som behövs för att assay för BBB integritet under sena embryonala och tredje INSTAR larvstadier av D. melanogaster utveckling. Liknande metoder har beskrivits på andra ställen för att assay integriteten av BBB under utveckling, samt i vuxen stadier5,7,29,30. Beskrivningar av procedurer i material-och metod avsnitt är dock …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. F. Bryan Pickett och Dr Rodney Dale för användning av utrustning för injektion. Detta arbete finansierades genom forskningsfinansiering från Loyola University Chicago till MD, D.T., och J.J.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
Riferimenti
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin–novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- . BDSC Cornmeal Food Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017)
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetica. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Biologia dello sviluppo. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
