Analyse av blodkreft stem stamfar celle metabolisme
Summary
Blodkreft stammen stamceller (HSPCs) overgang fra en Quiescent tilstand til en differensiering tilstand på grunn av deres metabolske plastisitet under bloddannelse. Her presenterer vi en optimalisert metode for måling av mitokondrie åndedrett og Glykolysen av HSPCs.
Abstract
Blodkreft stammen stamceller (HSPCs) har forskjellige metabolske plastisitet, som tillater dem å gå over fra sine Quiescent staten til en differensiering stat å opprettholde kravene i bloddannelse. Det har imidlertid vært vanskelig å analysere metabolsk status (mitokondrie åndedrett og Glykolysen) av HSPCs på grunn av deres begrensede tall og mangel på optimaliserte protokoller for ikke-tilhenger, skjøre HSPCs. Her gir vi et sett av klare, trinn-for-trinn-instruksjoner for å måle metabolsk åndedrett (oksygenforbruk rate; OCR) og Glykolysen (ekstracellulære forsuring rate; ECAR) av murine benmarg-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Denne protokollen gir en høyere mengde LSK HSPCs fra murine benmarg, forbedrer levedyktigheten til HSPCs under inkubasjons, forenkler ekstracellulære Flux analyser av ikke-tilhenger HSPCs, og gir optimalisert injeksjon protokoller (konsentrasjon og tid) for narkotika målretting oksidativt fosforylering og glycolytic trasé. Denne metoden gjør at prediksjon av metabolsk status og helsen til HSPCs under blod utvikling og sykdommer.
Introduction
Siden levetiden til de fleste eldre blodlegemer er kort, er homeostase av blod avhengig av selv-fornyelse og differensiering av en lang levetid, men sjelden befolkning på blodkreft stamceller (HSPCs)1. HSPCs er Quiescent, men de er raske til å spre og gjennomgå differensiering ved stimulering for å opprettholde kravene i blod systemet. Som hver HSPC mobilnettet tilstand krever en unik bioenergetisk etterspørsel, den metabolske endringene er sentrale drivere av HSPC skjebne beslutninger. Derfor, tap av metabolsk plastisitet, ved å endre likevekt mellom fredfulle omgivelser, selv-fornyelse, og differensiering av HSPCs, fører ofte til myelo-eller lymfe-proliferativ lidelser. Sammen er forståelsen av metabolsk regulering av HSPC utvikling avgjørende for å avdekke mekanismer underliggende Hematologic ondartet2,3,4,5.
Mitokondrie åndedrett og Glykolysen genererer ATP for å drive intracellulære reaksjoner og produsere byggesteinene som er nødvendige for Makromolekyl syntese. Siden HSPCs har lav mitokondrie masse i forhold til differensiert celler6 og de oppholder fredfulle omgivelser i hypoxic benmarg nisjer, HSPCs primært stole på Glykolysen. Aktivering av HSPCs forbedrer deres mitokondrie metabolisme som fører til tap av fredfulle omgivelser og deres påfølgende inntreden i cellesyklusen. Slike metabolske plastisitet av HSPCs tillater vedlikehold av HSPC bassenget gjennom voksne liv6,7,8,9,10,11,12. Derfor er det avgjørende å undersøke deres metabolske aktiviteter, slik som oksygen forbruksraten (OCR; indeks av oksidativt fosforylering) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR; indeks av Glykolysen) for å analysere HSPC-aktiveringen og tilstandsstatusen. Både OCR og ECAR kan måles samtidig, i sanntid, ved hjelp av en ekstracellulære Flux analysator. Den gjeldende metoden krever imidlertid et stort antall celler og er optimalisert for tilhenger celler13. Siden HSPCs ikke kan isoleres i store mengder fra mus14, krever sortering for å få en ren befolkning, er ikke-tilhenger celler15, og kan ikke være kultivert over natten uten å unngå differensiering16, har det vært vanskelig å måle OCR og ECAR av HSPCs. Her gir vi et sett med klare, trinn-for-trinn-instruksjoner for å følge video-baserte opplæringsprogrammer om hvordan du kan måle metabolsk åndedrett og Glykolysen av få tusen murine benmarg-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi isolering av en maksimal mengde ren og levedyktig murine LSK HSPCs befolkning samt måling av deres Glykolysen og mitokondrie åndedrett med en ekstracellulære Flux analysator. Nærmere bestemt, overvinner protokollen følgende tekniske problemer for bruk av LSK HSPCs: i) den lave frekvensen av LSK HSPCs i murine benmarg14, II) lav basal metabolsk aktivitet av LSK HSPCs26, III) skjørhet av LSK HSPCs27, og IV) den ikke-overholdelse av L…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er delvis støttet av finansieringen støtte fra National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick ‘ s Foundation, og Pelotonia Foundation.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
Riferimenti
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family–role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine–molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
