Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste
Summary
As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) transitam de um estado quiescente para um estado de diferenciação devido à sua plasticidade metabólica durante a formação sanguínea. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a respiração mitocondrial e a glicolíse dos HSPCs.
Abstract
As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) têm plasticidade metabólica distinta, o que lhes permite fazer a transição de seu estado quiescente para um estado de diferenciação para sustentar as demandas da formação sanguínea. No entanto, tem sido difícil analisar o estado metabólico (respiração mitocondrial e glicolíse) dos HSPCs devido aos seus números limitados e à falta de protocolos otimizados para HSPCs frágeis não aderentes. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para medir a respiração metabólica (taxa de consumo de oxigênio; OCR) e glicolyse (taxa de acidificação extracelular; ECAR) de murine osso medula-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo fornece uma maior quantidade de HSPCs LSK da medula óssea da urina, melhora a viabilidade dos HSPCs durante a incubação, facilita análises de fluxo extracelular de HSPCs não aderentes e fornece protocolos de injeção otimizados (concentração e tempo) para medicamentos que visam a fosforilação oxidativa e vias glicolíticas. Este método permite a previsão do estado metabólico e da saúde dos HSPCs durante o desenvolvimento do sangue e doenças.
Introduction
Uma vez que a vida útil da maioria dos glóbulos maduros é curta, a homeostase do sangue depende da auto-renovação e diferenciação de uma população de longa duração, mas rara de células-tronco hematopoiéticas (HSPCs)1. HSPCs são quiescentes, mas eles são rápidos a proliferar e sofrer diferenciação após a estimulação para sustentar as demandas do sistema sanguíneo. Como cada estado celular HSPC requer uma demanda bioenergética única, as mudanças metabólicas são os principais impulsionadores das decisões de destino HSPC. Portanto, a perda da plasticidade metabólica, alterando o equilíbrio entre quiescência, autorenovação e diferenciação de HSPCs, muitas vezes leva a distúrbios mielo ou linfoproliferativos. Juntos, a compreensão da regulação metabólica do desenvolvimento do HSPC é fundamental para descobrir mecanismos subjacentes malignidades hematológicas2,3,4,5.
A respiração mitocondrial e a glicolíse geram ATP para conduzir reações intracelulares e produzir os blocos de construção necessários para a síntese de macromoléculas. Como os HSPCs têm baixa massa mitocondrial em comparação com células diferenciadas6 e sustentam quiescência em nichos de medula óssea hipóxico, os HSPCs dependem principalmente de glicolíse. A ativação de HSPCs aumenta seu metabolismo mitocondrial que leva à perda de quiescência e sua subsequente entrada no ciclo celular. Tal plasticidade metabólica dos HSPCs permite a manutenção dapiscina HSPC ao longo da vida adulta6,7,8,9,10,11,12. Portanto, é fundamental investigar suas atividades metabólicas, como a taxa de consumo de oxigênio (OCR; índice de fosforilação oxidativa) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR; índice de glicolyse) para analisar a ativação do HSPC e o estado de saúde. Tanto o OCR quanto o ECAR podem ser medidos simultaneamente, em tempo real, usando um analisador de fluxo extracelular. No entanto, o método atual requer um grande número de células e é otimizado para células aderentes13. Uma vez que os HSPCs não podem ser isolados em grandes quantidades de camundongos14,exigem a classificação para obter uma população pura, são células não aderentes15,e não podem ser cultivadas durante a noite sem evitar a diferenciação16, tem sido difícil medir o OCR e o ECAR de HSPCs. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para acompanhar tutoriais baseados em vídeo sobre como medir a respiração metabólica e a glicolíse de poucos milhares de HSPCs de medula óssea de urinasca1+c-Kit+ (LSK).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, demonstramos o isolamento de uma quantidade máxima de população de HSPCs lspcs de urina pura e viável, bem como a medição de sua glicolíse e respiração mitocondrial com um analisador de fluxo extracelular. Especificamente, o protocolo supera as seguintes questões técnicas para o uso de LSK HSPCs : i) a baixa frequência de LSK HSPCs na medula óssea de urina14, ii) baixa atividade metabólica basal de LSK HSPCs26, iii) a fragilidade dos LSK HSPCs<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é, em parte, apoiado pelo apoio financeiro dos Institutos Nacionais de Saúde (HL131645, CA016058), da Fundação St. Baldrick e da Fundação Pelotonia.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
Riferimenti
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