Анализ гематопоиетического метаболизма стволовых прародителей клеток
Summary
Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) переходят от состояния покоя к состоянию дифференциации из-за их метаболической пластичности во время формирования крови. Здесь мы представляем оптимизированный метод измерения митохондриального дыхания и гликолиза ГСПК.
Abstract
Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) имеют различные метаболические пластичности, что позволяет им перейти от их тихих состояние дифференциации государства для поддержания требований формирования крови. Тем не менее, было трудно проанализировать метаболический статус (митохондриальное дыхание и гликолиз) HSPCs из-за их ограниченного числа и отсутствие оптимизированных протоколов для неприсоединения, хрупкие HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций по измерению метаболического дыхания (коэффициент потребления кислорода; OCR) и гликолиз (внеклеточный уровень подкисления; ECAR) из морин костного мозга-ЛинияnegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs. Этот протокол обеспечивает большее количество LSK HSPCs из морин костного мозга, улучшает жизнеспособность HSPCs во время инкубации, облегчает внеклеточный анализ потока неприсоединения HSPCs, и обеспечивает оптимизированные протоколы инъекций (концентрация и время) для препаратов, направленных на окислительный фосфорилирование и гликолитические пути. Этот метод позволяет прогнозировать метаболическое состояние и здоровье ГСпК при развитии крови и заболеваниях.
Introduction
Так как продолжительность жизни большинства зрелых кровяных клеток коротка, гомеостаз крови опирается на самообновление и дифференциацию долгоживущей, но редкой популяции гематопоиетических стволовых клеток (HSPCs)1. HSPCs тихие, но они быстро размножаются и проходят дифференциацию при стимуляции для поддержания требований системы крови. Поскольку каждое клеточное состояние HSPC требует уникального биоэнергетического спроса, метаболические изменения являются ключевыми факторами решений судьбы HSPC. Таким образом, потеря метаболической пластичности, изменяя равновесие между quiescence, самообновления, и дифференциации HSPCs, часто приводит к миело- или лимфо-пролиферативных расстройств. Вместе понимание метаболической регуляции развития HSPC имеет решающее значение для выявления механизмов, лежащих в основе гематологических злокачественных новообразований2,3,4,5.
Митохондриальное дыхание и гликолиз генерируют АТФ для выработки внутриклеточных реакций и создания строительных блоков, необходимых для синтеза макромолекул. Так как HSPCs имеют низкую митохондриальную массу по сравнению с дифференцированными клетками6, и они поддерживают quiescence в гипоксических нишах костного мозга, HSPCs в первую очередь полагаются на гликолиза. Активация HSPCs повышает их митохондриальный метаболизм, что приводит к потере покоя и их последующего вступления в клеточный цикл. Такая метаболическая пластичность HSPCs позволяет обслуживание бассейна HSPC на протяжениивсейвзрослой жизни6,7,8,9,10,11,12. Поэтому крайне важно исследовать их метаболическую активность, такую как уровень потребления кислорода (OCR; индекс окислительного фосфорилирования) и внеклеточный уровень подкисления (ECAR; индекс гликолиза) для анализа активации HSPC и состояния здоровья. И OCR, и ECAR могут быть измерены одновременно, в режиме реального времени, с помощью внеклеточного анализатора потока. Тем не менее, текущий метод требует большого количества клеток и оптимизирован для клеток адептов13. Так как HSPCs не могут быть изолированы в больших количествах от мышей14, требуют сортировки для получения чистой популяции, являются неприсоединения клетки15, и не могут быть культивированы в одночасье, избегая дифференциации16, было трудно измерить OCR и ECAR HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций для сопровождения видео-уроки о том, как измерить метаболическое дыхание и гликолиз несколько тысяч морин костного мозга-LineagenegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы демонстрируем изоляцию максимального количества чистого и жизнеспособного мурина популяции LSK HSPCs, а также измерение их гликолиза и митохондриального дыхания с помощью внеклеточного анализатора потока. В частности, протокол преодолевает следующие технические вопросы для ис?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается при финансовой поддержке Национальных институтов здравоохранения (HL131645, CA016058), Фонда Святого Болдрика и Фонда Пелотонии.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
Riferimenti
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family–role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine–molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
