Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis
Summary
Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay ein, um das phototaktische Verhalten von Drosophila larval zu untersuchen. In diesem Test wird ein Lichtfleck als Lichtstimulation erzeugt, und der Prozess der Larvenlichtvermeidung wird durch ein infrarotlichtbasiertes Bildgebungssystem aufgezeichnet.
Abstract
Die Larven von Drosophila melanogaster zeigen ein offensichtliches lichtvermeidendes Verhalten während der Futterphase. Drosophila larval phototaxis können als Modell verwendet werden, um das Verhalten von Tieren zu untersuchen. Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay ein, um das phototaktische Verhalten der Larven zu untersuchen. Die experimentelle Einrichtung umfasst zwei Hauptteile: ein visuelles Stimulationssystem, das den Lichtfleck erzeugt, und ein infrarotlichtbasiertes Bildgebungssystem, das den Prozess der Larvenlichtvermeidung aufzeichnet. Dieser Test ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens von Larven vor dem Betreten, während der Begegnung und nach dem Verlassen des Lichtflecks. Details der Larvenbewegung, einschließlich Verzögerung, Pause, Kopfgießen und Drehen können mit dieser Methode erfasst und analysiert werden.
Introduction
Die Larven von Drosophila melanogaster zeigen ein offensichtliches lichtvermeidendes Verhalten während der Futterphase. Drosophila larval phototaxis wurde untersucht, vor allem in den letzten 50 Jahren1,2,3,4,5,6,7 ,8. In den letzten Jahren wurden trotz der Tatsache, dass 1) viele Neuronen, die Larvenlichtvermeidung vermitteln,identifiziert4,5,9,10,11,12 und 2) das komplette Connectome des Larven-Visuellen Systems bei der Auflösung von Synapsen wurde13etabliert, die neuronalen Mechanismen, die Larvenphototaxis zugrunde liegen, bleiben weitgehend unklar.
Eine Reihe von Verhaltens-Assays wurden verwendet, um Larven-Phototaxis zu studieren. Sie lassen sich weitgehend in zwei Klassen unterteilen: eine mit räumlichen Lichtgradienten und die andere mit zeitlichen Lichtgradienten. Bei räumlichen Lichtgradienten-Assays ist die Arena in gleiche Anzahl von Abschnitten in Hell und Dunkel unterteilt. Die Arena kann in helle und dunkle Hälften2,4 oder helle und dunkle Quadranten14,15, oder kann sogar in alternative helle und dunkle Quadrate wie auf einem Schachbrett7getrennt werden. Normalerweise werden Agarplatten für räumliche Lichtgradienten-Assay verwendet, aber Rohre, die in alternative helle und dunkle Abschnitte unterteilt sind, können auch10,14verwendet werden.
In älteren Versionen von Assays stammt die Lichtbeleuchtung in der Regel von unterhalb der Larven. Die Beleuchtung in neueren Versionen stammt jedoch weitgehend von oben, da Larvenaugen (z. B. die Organe des Bolwig, die empfindlich auf niedrige oder mittlere Lichtintensitäten16) im undurchsichtigen Cephalopharyngealskelett mit Öffnungen in Richtung die obere Vorderseite. Dies macht Larven empfindlicher gegenüber Licht aus oberen vorderen Richtungen als von unten hinter Denrichtungen7. Bei zeitlichen Lichtgradienten-Assays ist die Lichtintensität in der Arena räumlich einheitlich, aber die Intensität ändert sich im Laufe der Zeit. Neben zeitlichem Rechtecklicht (d.h. blinkendes ein/aus oder starkes/schwaches Licht3,7) wird zeitlich variierendes Licht, das einer linearen Rampe in der Intensität entspricht, auch8 verwendet, um die Empfindlichkeit von Larven zeitlich wechselnden Lichtreiz.
Eine dritte Art von Phototaxis Assay ist die richtungsweisende Licht-Landschaftsnavigation, die Beleuchtung von oben in einem Winkel von 45°7beinhaltet. Vor der Arbeit von Kane et al.7wurden in Larven-Phototaxis-Assays nur grobe Parameter wie die Anzahl der Larven in hellen und dunklen Regionen, die Drehhäufigkeit und die Spurlänge berechnet. Seit der Arbeit dieser Gruppe, mit der Analyse von hochzeitlichen Auflösung Videoaufzeichnung für Larven-Phototaxis, detaillierte Dynamik der Larvenbewegung während Phototaxis (d.h. sofortige Geschwindigkeiten von verschiedenen Teilen des Larvenkörpers, Richtung, Wendewinkel und die entsprechende Winkelgeschwindigkeit) wurden analysiert7. So konnten weitere Details des Larven-Phototaxis-Verhaltens entdeckt werden. In diesen Tests werden Larven in Gruppen getestet, so dass Gruppeneffekte nicht ausgeschlossen werden.
Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay zur Untersuchung von Larvenverhaltensreaktionen auf die individuelle Lichtstimulation ein. Die Hauptanlage besteht aus einem visuellen Stimulationssystem und einem lichtbasierten Infrarot-Bildgebungssystem. Im visuellen Stimulationssystem erzeugt eine LED-Lichtquelle einen rund 2 cm großen Lichtfleck auf einer Agarplatte, wo die Larve getestet wird. Die Lichtintensität kann mit einem LED-Treiber eingestellt werden. Das Bildgebungssystem umfasst eine Infrarotkamera, die das Verhalten der Larve sowie drei 850 nm Infrarot-LEDs erfasst, die die Beleuchtung der Kamera ermöglichen. Das Objektiv der Kamera wird mit einem 850 nm Bandpassfilter abgedeckt, um das Licht des visuellen Stimulationssystems am Eindringen in die Kamera zu hindern, während das Infrarotlicht in die Kamera eindringen darf. So wird eine Störung der visuellen Stimulation bei der Bildgebung verhindert. In diesem Test werden die Verhaltensdetails der schnellen Reaktionen einzelner Larven innerhalb eines Zeitraums, einschließlich vor, während und nach dem Eindringen ins Licht, aufgezeichnet und analysiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt den Lichtfleck-Assay vor, um die Fähigkeit von Drosophila-Larven zu testen, dem Licht zu entkommen. Dieser Test ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens von Larven vor dem Betreten, während der Begegnung und nach dem Verlassen eines Lichtflecks. Details der Larvenbewegung können erfasst und analysiert werden. Der Lichtfleck-Assay ist sehr einfach und besitzt eine starke Praktikabilität. Die Kosten für das gesamte Gerät sind nicht hoch. Im Experiment wird LED-Licht als Lichtquelle v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von der naturwissenschaftlichen Stiftung China (31671074) und fundamental Research Funds for the Zhejiang Provincial Universities (2019XZZX003-12) unterstützt.
Materials
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120˚ Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
Riferimenti
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