Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil
Summary
Bu protokol, Drosophila larva fototaktik davranışını araştırmak için ışık noktası bir test sunar. Bu testte, ışık stimülasyonu olarak bir ışık noktası oluşturulur ve larva ışıktan kaçınma işlemi kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi tarafından kaydedilir.
Abstract
Drosophila melanogaster larvaları, yem leme aşamasında açık ışıktan kaçınma davranışı gösterir. Drosophila larva fototaksiler hayvan kaçınma davranışı çalışma için bir model olarak kullanılabilir. Bu protokol larva fototaktik davranışını araştırmak için bir ışık noktası teşp. Deneysel kurulum iki ana bölümden oluşur: ışık noktasını oluşturan bir görsel stimülasyon sistemi ve larva ışıktan kaçınma işlemini kaydeden kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi. Bu teşbit, larvanın ışık noktasını girmeden, karşılaşmadan önce ve ışık noktasından ayrıldıktan sonra izlenmesini sağlar. Yavaşlama, duraklama, baş dökümü ve tornalama gibi larva hareketinin ayrıntıları bu yöntemle yakalanabilir ve analiz edilebilir.
Introduction
Drosophila melanogaster larvaları, yem leme aşamasında açık ışıktan kaçınma davranışı gösterir. Drosophila larva fototaksis, özellikle son 50 yıl içinde1,2,3,4,5,6,7 soruşturma altında olmuştur ,8. Son yıllarda, 1) larva ışık kaçınma aracılık birçok nöronlar tespit edilmiştir olmasına rağmen4,5,9,10,11,12 ve 2) sinapsçözünen larva görme sisteminin komple konektom13kurulmuştur , larva fototaksis altında yatan nöral mekanizmalar büyük ölçüde belirsiz kalır.
Larva fototaksilerinin incelenmesinde bir takım davranışsal tahliller kullanılmıştır. Bunlar büyük ölçüde iki sınıfa ayrılabilir: biri uzaysal ışık gradyanlarını, diğeri de zamansal ışık gradyanlarını içeren. Uzamsal ışık degrade ssays için, arena ışık ve karanlık bölümlerin eşit sayıda ayrılır. Arena açık ve koyu yarıya bölünebilir2,4 veya açık ve koyu dörtlü14,15, hatta bir damatahtası7 gibi alternatif ışık ve karanlık kareler ayrılabilir . Genellikle, agar plakaları mekansal ışık gradyan tsay için kullanılır, ancak alternatif ışık ve karanlık bölümlere bölünmüş tüpler de kullanılabilir10,14.
Tahlillerin eski versiyonunda, ışık aydınlatması genellikle larvaların altından kaynaklanır. Ancak, yeni versiyonlarda aydınlatma büyük ölçüde yukarıdan kaynaklanır, çünkü larva gözleri (örneğin, bolwig’in düşük veya orta ışık yoğunluklarına duyarlı organları16)opak sefaopharyngeal iskelette bulunan ve açıklıkları olan üst cephe. Bu da larvaları üst cephe yönlerden gelen ışığa karşı daha duyarlı halegetirir. Zamansal ışık degrade syon için, ışık yoğunluğu arenada mekansal olarak düzgündür, ancak yoğunluk zamanla değişir. Temporal kare dalga ışığına ek olarak (örn. yanıp sönen açık/kapalı veya güçlü/zayıf ışık3,7), yoğunlukta doğrusal bir rampaya uyan zamansal değişen ışık da larvaların şiddetini ölçmek için8 zamansal olarak değişen ışık uyarıcı.
Fototaksit tsay üçüncü bir türü yön ışık scape navigasyon, 45 °7bir açıyla yukarıdan aydınlatma içerir. Kane ve ark.7çalışmalarından önce, larva sayısı, dönüş sıklığı ve iz uzunluğu gibi kaba parametreler larva fototaksis tahlillerinde hesaplanmıştır. Bu aynı grubun çalışmalarından bu yana, larva fototaksisleri için yüksek zamansal çözünürlüklü video kaydının analizi ile, fototaksis sırasında larva hareketinin ayrıntılı dinamikleri (yani larva gövdesinin farklı kısımlarının anlık hızları, yön başlığı, dönüş açısı ve buna karşılık gelen açısalhız) 7 analiz edilmiştir. Böylece larva fototaksisi davranışının daha fazla ayrıntısı keşfedilebilmiştir. Bu tahlillerde larvalar gruplar halinde test edilir, böylece grup etkileri dışlanmaz.
Bu protokol, bireysel ışık stimülasyonuna larva davranışsal yanıtların araştırılması için bir ışık noktası teşpiği sunar. Ana deneysel kurulum görsel stimülasyon sistemi ve kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi oluşur. Görsel stimülasyon sisteminde, bir LED ışık kaynağı larva test edildiği bir agar plaka üzerinde yuvarlak 2 cm çapında ışık noktası oluşturur. Işık yoğunluğu bir LED sürücüsü kullanılarak ayarlanabilir. Görüntüleme sistemi, kamera için aydınlatma sağlayan üç adet 850 nm kızılötesi LED’e ek olarak larvanın davranışını yakalayan bir kızılötesi kamera içerir. Kameranın merceği, görsel stimülasyon sisteminden gelen ışığın kameraya girmesini engellemek için 850 nm bant geçiş filtresi ile kaplanırken, kızılötesi ışığın kameraya girmesine izin verilir. Böylece görüntülemede görsel uyarılmanın girişime karışması önlenmiş olur. Bu testte, ışık tan önce, sırasında ve girdikten sonra dahil olmak üzere bir süre içinde bireysel larvaların hızlı tepkilerinin davranış detayları kaydedilir ve analiz edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, Drosophila larvalarının ışıktan kaçabilme yeteneğini test etmek için ışık noktası testini sunuyor. Bu teşbit, larvaların girilmeden önce, karşılaşma sırasında ve ışık noktasını terk ettikten sonra davranışlarının izlenmesini sağlar. Larva hareketinin ayrıntıları yakalanabilir ve analiz edilebilir. Işık nokta sıcazarlığı çok basittir ve güçlü pratiktedir. Tüm cihazın maliyeti yüksek değildir. Deneyde, LED ışığı ışık kaynağı olarak kullanılır….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Doğa Bilimleri Vakfı (31671074) ve Zhejiang İl Üniversiteleri (2019XZZX003-12) için Temel Araştırma Fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120˚ Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
Riferimenti
- Grossfield, J. Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).
- Godoy-Herrera, R. C. L. D. The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation. Animal Behaviour. 37, (1989).
- Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions. Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends in Neurosciences. 35, (2012).
- Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).
- Humberg, T. H., et al. Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues. Nature Communications. 9. 1260, (2018).
- Gong, Z., et al. Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference. Science. 330, (2010).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341, 1113 (2013).
- Zhao, W., et al. A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference. Nature Communications. 10, (2019).
- Gong, C., et al. A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance. Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).
- Larderet, I., et al. Organization of the Drosophila larval visual circuit. eLife. 6, (2017).
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. Journal of Neurogenetics. 10, (1995).
- Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921 (2010).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, e41642 (2012).
