Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever
Summary
Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.
Abstract
Lever repopulatie na letsel is een cruciaal kenmerk van zoogdieren die onmiddellijk orgaan falen en overlijden na blootstelling van milieu-toxines voorkomt. Een dieper begrip van de veranderingen in genexpressie die optreden tijdens de herbevolking kan helpen bij het identificeren van therapeutische doelen ter bevordering van het herstel van de leverfunctie bij het instellen van verwondingen. Niettemin, methoden om specifiek te isoleren van de herbevolkingende hepatocyten worden geremd door een gebrek aan celmarkeringen, beperkte celaantallen, en de kwetsbaarheid van deze cellen. De ontwikkeling van het vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) technologie in combinatie met de Fah-/- Mouse model te even herbevolking in de setting van leverletsel maakt het mogelijk genexpressie profilering van de repopulatie hepatocyten. Met TRAP, Cell Type-specifieke vertalen mRNA is snel en efficiënt geïsoleerd. We ontwikkelden een methode die gebruik maakt van TRAP met affiniteit gebaseerde isolatie van het vertalen van mRNA van hepatocyten die selectief uitdrukken het groene fluorescerende eiwit (GFP)-tagged ribosomale eiwitten (RP), GFP: RPL10A. TRAP omzeilt de lange periode die nodig is voor het sorteren van fluorescentie-geactiveerde cellen die het genexpressie profiel kunnen veranderen. Bovendien, aangezien alleen de herbevolkende hepatocyten Express de GFP: RPL10A fusie-eiwit, de geïsoleerde mRNA is verstoken van besmetting van de omringende geblesseerde hepatocyten en andere celtypen in de lever. De affiniteits-gezuiverde mRNA is van hoge kwaliteit en maakt downstream PCR-of high-throughput sequencing-gebaseerde analyse van genexpressie mogelijk.
Introduction
Als de belangrijkste metabole orgaan in gewervelde dieren, de lever is verantwoordelijk voor glucose homeostase, serumeiwit synthese, gal zuur secretie, en xenobiotische metabolisme en detoxificatie. De lever bezit een buitengewone capaciteit om het geblesseerde parenchym te regenereren bij blootstelling aan toxines om onmiddellijke leverfalen1te voorkomen. Echter, falen van regeneratie kan optreden in de setting van paracetamol of alcohol overconsumptie, wat kan leiden tot acuut leverfalen2. Bovendien, chronische leverschade veroorzaakt door virale hepatitis infectie, vette leverziekte, en Steatohepatitis kan leverfibrose veroorzaken, cirrose, en hepatocellulaire carcinoom3. De enige beschikbare curatieve behandeling voor eindstadium leverziekte is transplantatie, maar wordt beperkt door orgaan tekort, waardoor een efficiënte behandeling voor alle patiënten4. Een beter begrip van het herstelproces na toxische leverbeschadiging is daarom cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen om regeneratie te stimuleren die voldoende is om de functie in het zieke orgaan te redden.
Het meest breed toegepaste modelsysteem voor de studie van lever regeneratie is partiële hepatectomie bij knaagdieren, waarbij een groot deel van de lever wordt doorgeperfectioneerd om snelle hepatocyten uitbreiding5te stimuleren. Echter, partiële hepatectomie niet recapituleren hepatocyten expansie na toxische leverschade als gevolg van het gebrek aan immuuncel infiltratie en hepatocyten cel necrose vaak waargenomen in de setting van acute leverschade bij de mens6. Een geschikter systeem om deze vorm van orgel vernieuwing te modelleren is de Fah-/- Mouse, die geen functionele fumarylacetoacetaat hydrolase (FAH) vereist voor een goede tyrosine metabolisme en ontwikkelt ernstige leverschade leidt tot de dood7. Deze muizen kunnen worden gehandhaafd in een gezonde toestand voor onbepaalde tijd door behandeling met de drug nitisinon in het drinkwater. Als alternatief kan Fah expressie worden hersteld door transgen levering aan een subset van hepatocyten, die zal uitbreiden naar de lever opnieuw bevolken op nitisinon verwijderen8.
Voor het profiel van de genetische expressie veranderingen van het herbevolgen van hepatocyten, een instrument om specifiek te isoleren repliceren hepatocyten in de Fah-/- Mouse zonder besmetting van de naburige gewonde hepatocyten en andere celtypen is vereist. Helaas, fluorescentie-geassisteerde celsortering (FACS) van hepatocyten is moeilijk sinds (1) de kwetsbaarheid van het hervullen van hepatocyten leidt tot slecht herstel na lever perfusie, (2) replicerende hepatocyten zijn zeer variabel in grootte, waardoor isolatie van een zuivere populatie door FACS moeilijk, en (3) de procedure tijd van lever perfusie tot RNA-isolatie is groter dan 2 uur, vandaar dat genexpressie profielen aanzienlijke kunstmatige veranderingen kunnen ondergaan voordat monsters worden verworven9.
Als alternatief kan de uitdrukking van met epitope gelabelde ribosomen die specifiek zijn voor het hervullen van hepatocyten, de snelle isolatie van actief vertalen van mRNA gebonden door ribosomen met behulp van affiniteits zuivering onmiddellijk na orgaanoogst, met bulk lever weefsel lysaten. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van vertalen-ribosome affiniteits zuivering (TRAP)10 gevolgd door RNA-sequencing met hoge doorvoer (trap-SEQ), om specifiek mRNA te isoleren en te profiel bij het hervullen van hepatocyten in de Fah-/- muis9. Coexpressie van groen fluorescerend eiwit-gelabeld ribosomaal eiwit (GFP: RPL10A) met FAH maakt affiniteits zuivering van het vertalen van mRNA gebonden door polysomes met GFP: RPL10A. Deze methode vermijdt elke celdissociatie stappen, zoals lever perfusie om fragiele repopulatie hepatocyten te isoleren. In plaats daarvan maakt het gebruik van Lysis van heel orgaanweefsel en antilichamen om snel het RNA specifiek uit de doelcellen te halen. Tot slot maakt het isoleren van overvloedige, kwalitatief hoogwaardige mRNA via TRAP-SEQ downstreamtoepassingen zoals sequentieanalyse mogelijk om de dynamische verandering van genexpressie tijdens het repopulatie proces te profiel.
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-SEQ is een techniek voor celtypespecifieke isolatie van het vertalen van mRNA via epitope-Tagged ribosomen en presenteert een alternatief voor FACS benaderingen, als het omzeilt beperkingen zoals tijd vereisten van FACS9. In plaats daarvan, TRAP maakt snelle en efficiënte isolatie van RNA rechtstreeks uit bulk weefsels, helpen om te voorkomen dat eventuele veranderingen in genexpressie. De trap-SEQ is bijzonder geschikt voor gebruik in de herbevolkende Fah-/- Mouse lever…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de volgende subsidies: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) en P30-DK050306 (Pilot Grant aan KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
Riferimenti
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
- Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
- Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
- Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
- Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
- NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
- NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
- Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
- Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
- Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
- Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
- Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
- Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets–a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).
