סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר
Summary
מתרגם הריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת) מאפשר בידוד מהיר ויעיל של סוג תא ספציפי לתרגם mRNA. כאן, אנו מדגימים שיטה המשלבת הזרקת זנב הידרודינמי במודל העכבר של אוכלוסיית הכבד והמלכודת כדי לבחון את פרופיל הביטוי של אכלוס מחדש של hepatocytes.
Abstract
אוכלוסיית הכבד לאחר הפציעה היא תכונה קריטית של יונקים אשר מונע כשל איברים מיידיים ומוות לאחר חשיפת רעלים סביבתיים. הבנה עמוקה יותר של השינויים בביטוי הגנים המתרחשים במהלך האוכלוסיה יכולה לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות כדי לקדם את שיקום תפקודי הכבד בקביעת הפציעות. עם זאת, שיטות לבודד במיוחד את האכלוס מחדש של hepatocytes מעוכבים על ידי חוסר של סמנים תא, מספרי תאים מוגבלים, ואת שבריאת התאים האלה. ההתפתחות של תרגום הריבוכמה הזיקה של טיהור (מלכודת ) הטכנולוגיהבשילוב עם פה-/- מודל העכבר כדי לשחזר את האוכלוסייה מחדש במסגרת של פגיעה בכבד מאפשר פרופיל ביטוי גנים של האכלוס מחדש הפטציטים. עם המלכודת, סוג תא ספציפי לתרגם mRNA הוא במהירות וביעילות מבודד. פיתחנו שיטה אשר משתמשת מלכודת עם אהדה מבוססת בידוד של תרגום mRNA מ hepatocytes כי באופן סלקטיבי לבטא את חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויג חלבון ריבוזומבית (RP), GFP: RPL10A. ההשמנה מפעילה את פרק הזמן הארוך הנדרש למיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית שיכולה לשנות את פרופיל ביטוי הגנים. יתר על כן, מאז רק האכלוס מחדש של hepatocytes לבטא GFP: RPL10A היתוך חלבון, mRNA המבודד הוא נטול זיהום של hepatocytes הפצועים שמסביב וסוגי תאים אחרים בכבד. MRNA מטוהר האהדה הוא באיכות גבוהה ומאפשר במורד הזרם PCR או התפוקה הגבוהה ניתוח מבוסס רצף של ביטוי גנים.
Introduction
כמו איבר חילוף החומרים העיקרי של בעלי חוליות, הכבד אחראי על הומאוסטזיס גלוקוז, סרום חלבון סינתזה, הפרשה חומצה מרה, ומטבוליזם xenoביוטי ודטוקסיפיקציה. הכבד בעל יכולת יוצאת דופן כדי לחדש את כימוכימה הפצועים בעת החשיפה לרעלים כדי למנוע כשל כבד מיידית1. עם זאת, כישלון של התחדשות יכול להתרחש בהגדרה של פרצטמול או אלכוהול צריכת יתר, אשר יכול להוביל לכשל כבד אקוטי2. יתר על כן, פגיעה בכבד כרונית נגרמת על ידי דלקת הפטיטיס ויראלי, מחלת כבד שומני, ו steatohepatitis יכול לגרום פיברוזיס בכבד, שחמת, ו סרטן hepatocellular3. הטיפול הרפואי היחיד הזמין עבור מחלת הכבד בשלב הסופי הוא השתלת אבל הוא מוגבל על ידי המחסור איברים, מניעת טיפול יעיל עבור כל המטופלים4. הבנה טובה יותר של תהליך ההחלמה לאחר פגיעה בכבד רעיל הוא אפוא חיוני לפיתוח של טיפולים לעורר התחדשות מספיק כדי להציל את תפקוד האיבר החולה.
המערכת הרחבה ביותר מודל שימושית לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת המעי חלקית במכרסמים, שבו חלק גדול של הכבד הוא resected כדי לעורר הרחבת hepatectomy מהירה5. עם זאת, כריתת הפפאציט חלקית לא לכידה התרחבות hepatectomy בעקבות פגיעה בכבד רעיל בשל היעדר חדירת תאים חיסוניים ונמק תא hepatectomy נצפו לעתים קרובות בקביעת פציעה חמורה בכבד בבני אדם6. מערכת מתאימה יותר כדי לדגמן צורה זו של התחדשות איברים הוא פה -/- עכבר, אשר חסר פונקציונלי fumarylacetoacetate (אח) נדרש עבור חילוף החומרים הנכון טירולה, מפתחת נזק כבד חמור המוביל למוות7. עכברים אלה יכולים להישמר במצב בריא ללא הגבלה על ידי טיפול עם התרופה nitisinone במים השתייה. לחילופין, ביטוי פה יכול להיות משוחזר על ידי המסירה הטרנסגנטית לקבוצת משנה של hepatocytes, אשר תרחיב לאכלס את הכבד על ידי הסרת nitisinone8.
כדי לפרופיל את השינויים בביטוי הגנים של אכלוס מחדש של hepatocytes, כלי כדי לבודד באופן ספציפי שכפול hepatocytes ב-פה-/- עכבר ללא זיהום של hepatocytes השכןנפגע וסוגי תאים אחרים נדרש. למרבה הצער, מיון תאים בסיוע בלתי מבוקר (FACS) של hepatocytes הוא קשה מאז (1) שבריאת האכלוס מחדש של hepatocytes מוביל להחלמה ירודה לאחר הכבד פרזיה, (2) שכפול hepatocytes הם מאוד משתנה בגודל, עושה בידוד של אוכלוסייה טהורה על ידי facs קשה, ו (3) את זמן ההליך מתוך זלוף הכבד כדי בידוד RNA הוא גדול מ 2 h, ולכן פרופילי ביטוי גנים עשויים לעבור שינויים מלאכותיים משמעותי לפני שנרכשו דגימות9.
לחילופין, הביטוי של אפימוטים-מתויג הריבוזומים במיוחד באכלוס מחדש של hepatocytes מאפשר הבידוד המהיר של באופן פעיל בתרגום mRNA כרוך על ידי הריבוזומים באמצעות טיהור אהדה מיד לאחר הקציר איברים, עם כבד בתפזורת רקמות כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבצע תרגום-ריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת)10 ולאחריה תפוקה גבוהה RNA-רצף (השמנה-seq), כדי לבודד במיוחד פרופיל mrna באכלוס מחדש של hepatocytes ב- אח-/- עכבר9. Coexpression של חלבון פלורסנט ירוק-מתויג חלבון ריבוזומלי (GFP: RPL10A) עם פה מאפשר טיהור אהדה של תרגום mRNA כרוך על ידי פוליזומים המכילים GFP: RPL10A. שיטה זו מונעת כל שלבי הדיסוציאציה של התאים, כגון מיזוג כבד כדי לבודד את האכלוס מחדש של המופיציטים. במקום זאת, היא משתמשת הליזה של רקמת איברים שלמים ונוגדנים לחלץ במהירות RNA במיוחד מתאי היעד. בסופו של דבר, בידוד שופע של mRNA באיכות גבוהה באמצעות השמנה-seq מאפשר יישומים במורד הזרם כגון ניתוח רצף לפרופיל השינוי הדינאמי של ביטוי הגנים במהלך תהליך האכלוס מחדש.
Protocol
Representative Results
Discussion
מלכודת seq היא טכניקה עבור סוג תא ספציפי בידוד של תרגום mRNA באמצעות אפיזומים מתויג ומציג חלופה לגישות FACS, כפי שהוא מוגבל מגבלות כגון דרישות הזמן של FACS9. במקום זאת, המלכודת מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של RNA ישירות מרקמות בצובר, ומסייע למנוע כל שינוי בביטוי הגנים. מלכודת seq מתאימה במיוחד…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), ו P30-DK050306 (פיילוט מענק KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
Riferimenti
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
- Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
- Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
- Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
- Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
- NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
- NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
- Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
- Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
- Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
- Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
- Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
- Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets–a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).
